LC-MS/MS测定蜂胶食品中12种酚类物质的含量

本文使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪LCMS-8045建立了蜂胶食品中12种酚类物质同时测定的方法。实验结果表明，在0.01-1 μg/mL浓度范围内线性关系良好，各物质的线性相关系数均大于0.999，曲线各浓度点准确度在91.5%-109.1%之间。0.05 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL浓度的对照品溶液，连续进样6次，保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD%)分别在0.09%-0.50%和1.73%-4.86%之间。20、100和500 μg/g三个不同浓度加标平均回收率在85.4%-93.1%、81.4%-96.7%、83.6%-95.3%之间。12种酚类物质的LOQ均为0.01 μg/mL，测试结果均优于标准要求的0.02 μg/mL的定量限值，能够满足GB/T 19427—2022《蜂胶中12种酚类化合物含量的测定 液相色谱-串联质谱法和液相色谱法》标准方法需求，可适用于相关行业的质量控制及分析检验工作。SSL-CA23-227 Excellence in ScienceLCMSMS-793 LC-MS/MS 测定蜂胶食品中12种酚类物 质的含量 LCMSMS-793 摘要：本文使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪建立了蜂胶食品中12种酚类物质同时测定的方 法。实验结果表明， 在 0.01-1 ug/mL浓度范围内，方法线性良好，各物质的线性相关系数均大于 0.999， 曲 线各浓度点准确度在91.5%-109.1%之间。0.05 ug/mL、0.5 ug/mL、1 ug/mL 浓度的对照品溶液，连续进 样6次，保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD%)分别在0.09%-0.50%和1.73%-4.86% 之间。20、100和 500 pg/g 三个不同浓度加标的平均回收率在85.4%-93.1%、81.4%-96.7%、83.6%-95.3%之间，12种酚 类物质的 LOQ 为 0.01 ug/mL。该方法简单，稳定，准确，可供相关实验人员参考使用。 关键词：超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪蜂胶食品 酚类物质 技术特点： 心该方法定量限值优于标准要求的定量限值。 ◇应对 GB/T 19427-2022《蜂胶中12种酚类化合物含量的测定》。 蜂胶是植物树脂分泌物与蜂蜡、花粉等混合形成 在食品工业中，蜂胶因其具有很高的营养及医疗 的粘性物质。蜂胶的功能与所含有的活性成分密切相 价值，因此随着蜂胶在食品和保健品中的广泛应用，关，酚类化合物就是其中最重要的活性成分。蜂胶因 国家市场监管部门对蜂胶中的功能性物质逐渐关注，其含有多种活性成分，因此具有丰富的营养价值及医 2022年3月9日，由国家市场监督管理总局与国家 疗功效。酚类物质最早是在植物性食物中被发现的， 标准化管理委员会联合发布了 GB/T 19427-2022《蜂 因其具有潜在促进健康的作用，因此酚类物质也被科 胶中12种酚类化合物含量的测定液相色谱-串联质 研学者广泛关注。酚类化合物是一类有益健康的化合 谱法和液相色谱法》的检测方法，2022年10月1日 物，其共同特性是分子中都含有酚类特征基团，因而 正式实施。本文参照该标准，使用岛津三重四极杆液 具有较强的抗氧化功能。根据分子结构的不同，植物 质联用仪，建立了蜂胶产品中酚类物质的含量测定方 性食物中的酚类化合物可包含单酚、多酚、酚酸以及 法A，2可供相关实验人员参考。黄酮类物质。 系统控制器 CBM-20A 脱 气 机：DGU-20A5R 输液泵LC-30AD×2自动进样器：SIL-30AC 柱温 品 箱： CTO-20AC 色谱工作站： LabSolutions Ver. 6.108 质谱检测器号： LCMS-8045 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱：：Shim-pack GISS C18 (50 mm × 2.1 mm l.D.， 1.9 um)， P/N：227-30048-01，岛津(上海)实验器材有限公司 流动相A相-0.1%甲酸水溶液；B相-0.1%甲酸甲醇溶液 流速0.2 mL/min 进样体积2uL 柱温：30°℃ 洗脱方式：梯度洗脱 初始浓度： B相初始浓度为15%，时间程序见表1 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 1.00 Pumps Pump B Conc. 15 1.50 Pumps Pump B Conc. 30 3.00 Pumps Pump B Conc. 30 3.50 Pumps Pump B Conc. 40 5.00 Pumps Pump B Conc. 40 5.50 Pumps Pump B Conc. 60 6.50 Pumps Pump B Conc. 60 7.00 Pumps Pump B Conc. 70 8.00 Pumps Pump B Conc. 80 8.50 Pumps Pump B Conc. 100 10.50 Pumps Pump B Conc. 100 11.50 Pumps Pump B Conc. 15 15.00 Controller Stop 质谱条件： 离子源：ESI(+/-) DL 温 度：250°℃ 接口电压：+4 kV/-3kV 雾化气流速：3.0 L/min 加热气流速：110.0 L/min 加热模块温度：400°℃接口温度：300°℃干燥气流 10.0L/min 扫描模式速：多反应监测(MRM) MRM参 数：见表2 表212种酚类化合物 MRM参数 序号 化合物名称 CAS号 离子化 模式 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias(V) 1 绿原酸 327-97-9 负 353.15 191.15*85.00 18.0 16.0 20.0 25.0 46.0 16.0 2 咖啡酸 331-39-5 负 179.20 135.10*134.10 13.0 15.0 28.0 12.0 22.0 26.0 3 p-香豆酸 501-98-4 负 163.20 119.05*92.90 18.0 15.0 23.0 12.0 30.0 17.0 4 阿魏酸 1135-24-6 负 193.20 134.00*149.05 14.0 16.0 14.0 14.0 14.0 30.0 5 檞皮素 301.05 16.0 22.0 15.0 117-39-5 负 151.05* 179.10 15.0 18.0 20.0 6 莰菲醇 287.00 152.95* 68.95 -20.0 -32.0 -26.0 520-18-3 正 -14.0 -51.0 -28.0 7 芹菜素 520-36-5 负 269.10 117.05* 151.05 14.0 35.0 12.0 20.0 24.0 30.0 8 松属素 480-39-7 正 257.05 153.05* -18.0 -22.0 -27.0 131.20 -18.0 -20.0 -23.0 LCMSMS-793 9 短叶松素3-乙酸酯 52117-69-8 负 313.15 253.05* 271.10 16.0 20.0 18.0 16.0 18.0 19.0 10 柯因 480-40-0 正 255.05 153.05* -13.0 -30.0 -28.0 103.10 -13.0 -34.0 -17.0 11 高良姜素 548-83-4 正 271.00 153.05*91.20 -14.0 -30.0 -14.0 -14.0 -43.0 -15.0 12 阿替匹琳C 72944-19-5 负 299.20 255.20*200.20 15.0 18.0 29.0 15.0 23.0 14.0 注：*表示定量离子 1.3标准品制备 混合标准储备液：准确称取各标准物质适量，用甲醇定容至 10 mL 容量瓶中，制得1.0 mg/mL 标准储备 液。-20℃避光保存。 标准工作溶液：准确量取适量混合标准储备液，用甲醇-0.1%甲酸水(1：1)溶液稀释配制成0.01、0.05、0.1、0.5、1 ug/mL 混合标准系列工作溶液。 1.4样品前处理方法 结果与讨论 2.1色谱图 4：255.05>153.05(+) 4.42e5 RT (min) 图1 12种酚类化合物的定量离子色谱图 (0.1ug/mL) 2.2校准曲线及其检出限 按照1.3制备0.01、0.05、0.1、0.5、1 ug/mL 混合标准系列工作溶液，使用外标法拟合工作曲线，校准曲 线见图2。各浓度点线性回归的准确度及相关系数等结果见表3。将最低浓度为 0.01 ug/mL 的12种酚类物质 混合标准溶液，按1.2中的分析条件进行上机实测，12种酚类物质的实测检出限和定量限情况见表3。在上述 实验条件下，12种酚类物质的 LOQ为 0.01 ug/mL， 实测结果表明仪器灵敏度良好，能够满足 GB/T 19427一 2022《蜂胶中12种酚类化合物含量的测定液相色谱-串联质谱法和液相色谱法》标准方法中的测定低限要求。 Conc. (ug/mL) 图2 部分酚类物质校准曲线 LCMSMS-793 表3校准曲线情况及检出限、定量限结果 NO. 化合物名称 线性范围(ug/mL) 准确度(%) 相关系数R 定量限(ug/mL) 1 绿原酸 0.01-1 93.8-102.9 0.9999 0.01 2 咖啡酸 0.01-1 94.1-101.4 0.9999 0.01 3 p-香豆酸 0.01-1 93.5-100.3 0.9998 0.01 4 阿魏酸 0.01-1 92.4-99.1 0.9997 0.01 5 桷皮素 0.01-1 98.3-101.8 0.9991 0.01 6 莰菲醇 0.01-1 93.7-107.7 0.9996 0.01 7 芹菜素 0.01-1 92.4-101.1 0.9997 0.01 8 松属素 0.01-1 91.5-102.6 0.9995 0.01 9 短叶松素3-乙酸酯 0.01-1 98.7-102.9 0.9998 0.01 10 柯因 0.01-1 95.5-104.4 0.9995 0.01 11 高良姜素 0.01-1 93.4-101.3 0.9991 0.01 12 阿替匹琳C 0.01-1 95.3-109.1 0.9999 0.01 2.3重复性考察 取低、中、高三个浓度的标准溶液，连续进样6次，仪器精密度实验考察结果见表4。该结果表明，各物质 保留时间的 RSD 在 0.09%-0.50%的范围，峰面积的 RSD 在 1.73%-4.86%的范围，以上数据表明仪器的精密度 良好。 表4重重复性结果(n=6) No. 化合物 RSD% (0.05 ug/mL) RSD% (0.5 ug/mL) RSD% (1 ug/mL) 保留时间 峰面积 保留时间 峰面积 保留时间 峰面积 1 绿原酸 0.50 3.72 0.41 4.38 0.47 4.64 2 咖啡酸 0.27 3.10 0.18 3.17 0.37 2.31 3 p-香豆酸 0.32 1.73 0.45 4.86 0.43 2.02 4 阿魏酸 0.19 4.29 0.19 3.14 0.14 1.09 5 桷皮素 0.43 3.55 0.34 2.70 0.41 3.07 6 莰菲醇 0.16 4.24 0.27 4.54 0.25 0.95 7 芹菜素 0.17 3.89 0.09 3.60 0.16 0.79 8 松属素 0.19 4.49 0.19 4.14 0.24 1.02 9 短叶松素3-乙酸酯 0.29 2.55 0.34 3.70 0.41 3.07 10 柯因 0.12 4.24 0.17 3.54 0.15 1.95 11 高良姜素 0.11 3.89 0.37 4.60 0.26 2.77 12 阿替匹琳C 0.17 2.89 0.19 2.14 0.34 3.02 2.4加标回收率考察 取含蜂胶的保健品样本一份，按照1.4的前处理方法，在20、100和500 ug/g三个加标浓度的水平下，进 行回收率实验，结果见表5。各样品平行测定3次，该测定结果显示，各物质在低中高三个浓度梯度的加标回 收率分别为 85.4%-93.1%、81.4%-96.7%、83.6%-95.3%之间，均满足该检测方法的条件要求。 LCMSMS-793 4：255.05>153.05(+) 6.26e3 RT (min) 图3 保健品样本谱图 4：255.05>153.05(+) 9.14e4 图4 保健品样本加标(20ug/g)谱图 表5 回收率测定结果((n=3) NO. 名称 样品 20 ug/g 100 ug/g 500 ug/g 平均值(ug/g) 平均回收率(%) 平均回收率(%) 平均回收率(%) 1 绿原酸 N.D. 92.3 96.7 95.3 2 咖啡酸 N.D. 91.8 90.9 93.6 3 p-香豆酸 N.D. 87.5 86.8 85.3 4 阿魏酸 N.D. 92.6 85.8 89.0 5 桷皮素 N.D. 85.4 86.2 91.5 6 莰菲醇 N.D. 86.6 81.4 86.2 7 芹菜素 N.D. 87.9 89.0 83.7 8 松属素 N.D. 93.1 91.8 92.7 9 短叶松素3-乙酸酯 N.D. 91.5 83.7 88.8 10 柯因 17.0 89.4 92.4 88.3 11 高良姜素 N.D. 85.8 89.5 83.6 12 阿替匹琳C N.D. 88.3 84.8 92.9 N.D.：表示未检出。 结论 本文使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪 LCMS-8045 建立了蜂胶食品中12种酚类物质同时测 定的方法。实验结果表明，在0.01-1 ug/mL 浓度范围内线性关系良好，各物质的线性相关系数均大于0.999，曲线各浓度点准确度在91.5%-109.1% 之间。0.05 ug/mL、0.5 ug/mL、1 ug/mL 浓度的对照品溶液，连续进 样6次，保留时间和峰面积的相对标准偏差((RSD%)分别在0.09%-0.50%和1.73%-4.86% 之间。20、100和 500 ug/g 三个不同浓度加标平均回收率在 85.4%-93.1%、81.4%-96.7%、83.6%-95.3% 之间。12种酚类物质 的 LOQ均为 0.01 ug/mL， 测试结果均优于标准要求的 0.02 ug/mL的定量限值，能够满足 GB/T 19427-2022《蜂 胶中12种酚类化合物含量的测定液相色谱-串联质谱法和液相色谱法》标准方法需求，可适用于相关行业的质 量控制及分析检验工作。 岛津应用云