使用氨基酸分析仪测定茶叶中21种氨基酸的含量

本实验使用岛津氨基酸分析仪LC-16AAA参考国标GB/T 30987-2020《植物中游离氨基酸的测定》用锂型分析柱建立了21种氨基酸茚三酮柱后衍生高效液相色谱分析方法。该方法表现出优良的重复性，回收率以及较高的灵敏度。岛津还能够提供对应的专属试剂包，免去试剂配制繁琐，实验人员操作过程误差等可能性，提升实验效率与准确性。氨基酸检测项目一站式搞定，省心省力。SSL-CA23-043Excellence in Science Excellence in ScienceLC-373 使用氨基酸分析仪测定茶叶中21种氨基酸 的含量 LC-373 摘要：本实验参考 GB/T 30987-2020《植物中游 离 氨基酸的 测 定》测试条件以茶叶为检测基质，使用岛津氨 基酸分析仪 LC-16AAA 建立了21种氨基酸茚 三 酮柱后衍生高效液相色谱分析方法 。实验结果表明：20种氨 基酸在7.81~500 nmol /L 浓度范围内，茶氨酸在 31.25~2000 nmol/L 浓度范围内，线性相关性良好，相关系 数均大于0.999， 准确度为83.7~117.4%。精密度实验中，15.63 nmol/L标准溶液(其中茶氨酸浓度为62.5nmol/L)峰面积 RSD%为 0.62~4.43%。该方法茚三酮柱后衍生和样品测定为全自动完成，线性好，分离效果佳，适合茶叶中游离氨基酸的测定，同时 也 为其他需要检 测 游离氨基酸项目的样品提供参考 。 关键词： LC-16AAA氨基酸分析仪锂型茚三酮柱后衍生茶叶 技术特点： 茶叶中的氨基酸不但能够补充人体内必需的氨基 酸 酸 ，，而且还会影响到茶汤的口感，茶叶的成色等等。对茶叶中氨基酸种类含量的检 测 是对市场上茶叶质量 的 一种关键控制手段。 本实验使用岛津氨基酸分析仪 LC-16AAA 锂型分 析柱参考国标 GB/T 30987-2020《植物中游离氨基酸 的 测定》，选用茶叶作为样品，检测其中21种游离氨 基酸含量，实现较好的分离，给其他食品等物质检测 游离氨基酸提供了更多可能性。 系统控 制 器：CBM-20A 自动进样器： SIL -16输 液 泵 灵：LC-16×3脱 气 机：：DGU-20A5R 阀切换单元：FCV-11AL 鼓泡单元： DGU-10B 化学反应箱：CRB-40柱 温 箱 ：CTO-16L 检 测 器 号：SPD-16色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.99 1.2分析条件 分 析 柱：：Shimadzu Shim-pack Amino-Li (100 mm×6.0 mml.D.，5um) (岛津(上海)实验器材有限公 司 ， P/N： 228-18837-92) 捕 氨 柱： Shimadzu Shim-pack ISC-30/S0504 L i (50 mm×4.0 mml .D.， 5um)(岛津 (上海)实验器材有限公司 ， P/N： 228-00821-91) 流 动 相： 锂型氨基酸流动相试剂包流动相 A，B，C (岛津(上海)实 验器材有限公司， P/N： 228-21195-95) 衍生试剂：茚三酮溶液 洗脱方式： 梯度洗脱，A相起始浓度为100%，时间程序如表1所示。 表1梯 度 洗脱时间程序 时间(min) 单元 处理命令 值 5.00 泵 B Conc 0 15.00 泵 B Conc 1 22.00 泵 B Conc 1 22.01 泵 B Conc 4 22.01 泵 B Curve 4 45.00 泵 B Conc 6 45.01 泵 B Conc 9 60.00 泵 B Conc 9 60.00 泵 B Curve -1 71.00 泵 B Conc 29 78.00 泵 B Conc 34 78.01 泵 B Curve -2 82.00 泵 B Conc 51 82.01 泵 B Curve 4 92.00 泵 B Conc 100 102.00 泵 SV(Pump A) B-A-A 127.00 泵 B Conc 100 127.01 泵 B Conc 0 130.00 泵 B Conc 0 130.00 泵 SV(PumpA) A-A-A 145.00 控制器 Stop 注： SV(PumpA)表示A 泵 溶剂切换阀， “值”中选择A和B代表不同的流动相。 1.3标准品 市售21种氨基酸混合标准品：1.25 umol/mL (茶氨 酸 浓度为5umol/L) 标准溶液：将市售21种氨基酸混合标准品与标准储备液1混合，并用流动相A逐级稀释成浓度为7.81、15.63、31.25、62.5、125、250和500 nmol/mL的溶液(其中茶氨酸浓 度 分别为31.25、62.5、125、250、500、1000和2000 nmol/mL)。 1.4样品前处理 ■结果与讨论 2.1化合物信息 表2 21种 氨 基酸 信 息表 序号 中文名称 英文缩写 CAS. 号 保留时间((min) 检测波长(nm) 1 天冬氨酸 Asp 56-84-8 18.98 570 2 苏氨酸 Thr 72-19-5 25.59 570 3 丝氨酸 Ser 56-45-1 28.26 570 4 天冬酰胺 Asn 56-86-0 31.19 570 5 谷氨酸 Glu 56-85-9 33.31 570 6 茶氨酸 The 147-85-3 38.84 570 7 谷氨酰胺 GIn 3081-61-6 43.06 570 8 甘氨酸 Gly 56-41-7 47.97 570 9 丙氨酸 Ala 72-18-4 53.70 570 10 缬氨酸 Val 52-90-4 57.03 570 11 半胱氨酸 Cys 63-68-3 60.28 570 12 蛋氨酸 Met 63-68-3 64.29 570 13 异亮氨酸 lle 61-90-5 67.61 570 14 亮氨酸 Leu 60-18-4 69.67 570 15 酪氨酸 Tyr 63-91-2 71.32 570 16 苯丙氨酸 Phe 56-12-2 81.80 570 17 氨基丁酸 GABA 73-22-3 88.48 570 18 组氨酸 Ans 56-87-1 102.65 570 19 赖氨酸 Lys 71-00-1 105.90 570 20 精氨酸 Arg 74-79-3 124.29 570 21 脯氨酸 Pro 56-40-6 46.25 440 2.2校准曲线和定量限 按1.2中的分析条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，采用外标法建立线性校准曲线，脯氨酸 的检测波长是440 nm， 其余20种氨基酸的检 测 波长是570 nm，结果如图1和图2所示，21种氨基酸在7.81~500nmol/L 浓度范围内，线性相关性良好，相关系数均大于0.999，准确度为83.7~117.4%。 根据最低浓度点标样数据，号，L 以10倍信噪比计算方法定量限，各化合物定量限和线性相关系数如表3所示。 图1 21种 氨基酸标准溶液图谱 (440nm，峰1为脯氨酸，表2中序号21；570 nm， 峰1-20序号同表2) 图2 部分氨基酸 校 准曲线 表 321种氨基酸相关系数及定量限 ID 组分名称 相关系数(R) 定量限 (ug/kg) ID 组分名称 相关系数(R) 定量限 (ug/kg) 1 天冬氨酸 0.9997 7.653 12 蛋氨酸 0.9997 16.972 2 苏氨酸 0.9993 8.935 13 异亮氨酸 0.9997 5.083 3 丝氨酸 0.9997 8.407 14 亮氨酸 0.9997 5.903 4 天冬氨酸 0.9998 37.489 15 酪氨酸 0.9997 8.607 5 谷氨酸 0.9997 6.942 16 苯丙氨酸 0.9997 8.260 6 茶氨酸 0.9997 10.888 17 氨基丁酸 0.9995 1.934 7 谷氨酰胺 0.9997 14.713 18 组氨酸 0.9995 5.625 8 甘氨酸 0.9997 5.912 19 赖氨酸 0.9995 22.294 9 丙氨酸 0.9999 3.786 20 精氨酸 0.9993 22.864 10 缬氨酸 0.9997 3.954 21 脯氨酸 0.9997 48.355 11 半胱氨酸 0.9998 15.588 2.3重复性实验 取 15.63 nmol/L 标准品溶液，连续进样6次，考 察仪器的重复性，测定结果见表4。实 验结果表明，该分 析方法具有良好的精密度。 表4221种氨基酸峰面积重复性结果 ID 组分名称 RSD(%) ID 组分名称 RSD(%) 1 天冬氨酸 3.46 12 蛋氨酸 0.62 2 苏氨酸 3.68 13 异亮氨酸 1.70 3 丝氨酸 2.07 14 亮氨酸 1.24 4 天冬氨酸 3.74 15 酪氨酸 2.06 5 谷氨酸 3.02 16 苯丙氨酸 3.26 6 茶氨酸 2.60 17 氨基丁酸 2.19 7 谷氨酰胺 1.23 18 组氨酸 2.60 8 甘氨酸 2.18 19 赖氨酸 2.55 9 丙氨酸 1.30 20 精氨酸 3.86 10 缬氨酸 2.01 21 脯氨酸 3.67 11 半胱氨酸 4.43 2.4实际 样 品分析 将市售茶 叶 按1.4样品前处理后，用1.2方法进样分析，色谱图如图3所示，所测样品中各氨基酸的含量如 表5所示。 图3 红茶样品色谱 图 (440nm，峰1为脯氨酸，表2中序号21；570nm，峰1-20序号同表2) 表5茶叶中 氨 基酸含量检 测 结果 ID 组分名称 样品结果 (nmol/L) 样品中氨基酸 含量(ug/kg) ID 组分名称 样品结果 (nmol/L) 样品中氨基酸 含量(ug/kg) 1 天冬氨酸 17.418 289.79 12 蛋氨酸 7.155 133.44 2 苏氨酸 7.689 114.50 13 异亮氨酸 8.177 134.08 3 丝氨酸 11.197 147.09 14 亮氨酸 4.845 79.45 4 天冬氨酸 13.247 218.77 15 酪氨酸 6.417 145.34 5 谷氨酸 8.767 161.24 16 苯丙氨酸 6.813 140.68 6 茶氨酸 241.311 5254.55 17 氨基丁酸 2.312 29.80 7 谷氨酰胺 1.941 35.46 18 组氨酸 未检出 未检出 8 甘氨酸 14.722 138.15 19 赖氨酸 9.691 177.09 9 丙氨酸 12.656 140.94 20 精氨酸 60.023 1307.00 10 缬氨酸 未检出 未检出 21 脯氨酸 13.192 189.85 11 半胱氨酸 未检出 未检出 2.5加标回收率 取2.4中样品溶液(样品中各氨基酸检出值详 见 表5)进行低浓 度 (20种氨基酸 7.81 nmol/L， 茶氨酸 31.25 nmol/L) 和中浓度(20种氨基酸 62.5 nmol/L， 茶氨 酸 250 nmol/L)；加标后，按照上述前处理方法处 理后上机，平行3份样品考察回收率和 RSD，具体结果如下：低浓度的加标回收率为82.2%-111.9%， RSD 为 0.74%-9.08%，中浓 度 的加标回收率为 78.7%-95.8%， RSD 为 0.26%-2.42%，回收率高，重现性好。 表6名各 组 分添加回收率结果 ID 组分名称 添加水平-低 添加水平-中 回收率(%) RSD(%) 回收率((%) RSD(%) 1 天冬氨酸 97.5 1.65 82.5 0.75 2 苏氨酸 82.2 1.28 81.4 1.71 3 丝氨酸 94.2 3.20 79.6 0.52 4 天冬酰胺 96.9 3.14 80.6 1.68 5 谷氨酸 91.4 3.27 82.7 0.90 6 茶氨酸 96.3 0.76 83.2 0.30 7 谷氨酰胺 89.6 1.33 78.7 0.91 8 甘氨酸 98.7 2.35 84.0 1.19 9 丙氨酸 84.9 7.20 82.0 0.26 10 缬氨酸 107.7 9.08 80.5 1.43 11 半胱氨酸 111.9 0.74 81.0 0.88 12 蛋氨酸 88.6 6.60 81.1 1.21 13 异亮氨酸 100.4 3.98 81.3 0.44 14 亮氨酸 99.9 2.36 83.0 0.17 15 酪氨酸 100.3 2.76 92.4 0.39 16 苯丙氨酸 92.8 1.85 82.7 0.75 17 氨基丁酸 84.4 0.99 81.4 0.29 18 组氨酸 87.4 2.75 81.8 3.33 19 赖氨酸 82.2 3.45 95.8 0.47 20 精氨酸 104.1 5.83 89.3 2.42 21 脯氨酸 91.8 4.11 80.0 0.39 ■结论 本实验使用岛津氨基酸分析仪 LC-16AAA 参考国标 GB/T 30987-2020《植物中游离氨基酸的测定》用锂型分 析柱建立了21种氨基酸茚三酮柱后衍生高效液相色谱分析方法。该方法表现出优良的重复性，回收率以及较高 的灵敏度。岛津还能够提供对应的专属试剂包，免去试剂配制繁琐，实验人员操作过程误差等可能 性 ，提升实 验效率 与 准确性。氨基酸检 测 项目一站式搞定，省心省力。 岛津应用云