人血清中24种抗抑郁药物检测方案(液质联用仪)

SSL-CA22-055Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-621 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS检测人血清中24种抗抑郁药物含量 LCMSMS-621 摘要：本文建立了一种使用岛津液相色谱质谱联用仪测定人血清中24种抗抑郁药物的定量分析方法。利用蛋白沉淀的前处理方法，以内标法建立标准曲线，线性范围涵盖临床参考区间，分别考察了方法的线性、准确度和精密度性能。结果显示各分析物线性范围内标准曲线相关系数均大于0.9958，方法准确度偏差在-9.43%~11.13%之间，精密度 RSD 均小于10.59%，可满足临床日常检验需求。该方法分析速度快，灵敏度高，专属性强，前处理简单，可为相关从业人员提供参考。 关键词：临床检测L-CMS/MS抗抑郁药物 抑郁症是一种独立的情绪障碍性精神疾病，主要表现为情绪低落，对周围事物缺乏兴趣，自我评价呈负面性，长期产生一些不良情绪，甚至轻生行为。 据不完全统计，目前我国抑郁症发病率高达5%~6%，近年来呈上升趋势，随着抗抑郁症新药品种的日益增多，临床治疗的用药难度和复杂性也随之增加，为完善抑郁症规范化治疗，实现用药剂量个体化，神经精神药理学与药物精神病学协会 (AGNP)的专家强烈推荐在抗抑郁药使用过程中开展血药浓度监测，了解患者的服药依从性以及药物间的相互作用，有助于确定合并用药原则。 目前临床上常用的抗抑郁药物有阿米替林、帕罗西汀、舍曲林、西酞普兰、文拉法辛、度洛西汀、米氮平等，这些药物大多治疗窗较窄，，个体差异较大，不同的抑郁病患者对各种抗抑郁药物的敏感度不同，通过开展血药浓度监测，可以帮助医生制订个体化给 药方案，实现精准治疗，降低用药风险。关于抗抑郁药物浓度监测的方法有免疫检测法、原子吸收法、色谱法，但上述方法在抗干扰能力、灵敏度和检测通量方面有一定局限性。 本文参考中国医师协会检验医师分会临床质谱检验医学专业委员会的《液相色谱串联质谱临床检测方法的开发与验证》，基于岛津LCMS-8045平台建立了一种简单高效的液相色谱质谱法同时测定人血清中多种抗抑郁药物的含量。 血清样本经蛋白沉淀和引入同位素内标后加水适当稀释后直接进样分析，内标法定量人血清中药物含量。该方法前处理过程方便快捷， 1针进样，6.5分钟内完成分析，实现24种常见抗抑郁药物的含量测定，大大提高了分析效率和检测通量，能满足临床样本的联合检测需求，供相关人员参考。 1.1仪器 本实验使用岛津临床质谱 LCMS-8045，具体配置如下：输液泵： LC-40B X3 检测器： LCMS-8045自动进样器： SIL-40CX3 柱温箱： CTO-40S系统控制器：SCL-40 工作站软件： LabSolutions Version 5.99 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack Velox SP-C18(50 mm × 2.1 mm ×1.8 um)，货号：227-32001-02 流动相：A相-水，B相-50%甲醇/乙腈 洗脱方式：梯度洗脱，时间程序见表1 流速： 0.3 mL/min 柱温：40℃ 进样器温度：15℃ 进样量：4uL 质谱条件 离子子模式： ESI(+) 离子源温度：300C 加热气：空气10.0 L/minDL管温度：200℃雾化气：氮气3.0L/min加热模块温度：400℃干燥气：氮气10.0L/min扫描模式：多反应监测(MRM)驻留时间：8~10 msMRM 参数：见表2 表2 MRM参数 35 去甲艾司西肽普兰-D 315.3000>113.1000 -13 -26 -20 36 西酞普兰-D 329.3000>113.1500 -13 -29 -20 37 米安色林-D。 268.3000>208.1500 -11 -21 -22 38 度洛西汀-D， 305.2000>44.2500 -12 -11 -18 39 氟伏沙明-D 322.3000>74.2000 -13 -17 -13 40 氯米帕明-D， 321.3000>92.3000 -13 -19 -17 41 去甲氯米帕明-D 304.2000>75.2500 -17 -17 -21 42 阿米替林-D 281.3000>233.2500 -11 -17 -25 43 去甲替林-D 267.3000>233.2000 -18 -14 -22 44 氟西汀-D， 316.3000>44.1500 -20 -13 -20 45 去甲氟西汀-D， 302.3000>140.2000 -24 -7 -26 46 曲唑酮-D， 378.3000>182.1500 -15 -25 -19 47 多塞平-D： 283.3000>107.1500 -11 -24 -19 48 N-去甲盐酸多塞平-D 269.3000>107.1000 -11 -22 -19 1.3样品制备和前处理 1.3.1标准品&内标信息 表3标准品信息 # 中文名 英文名 CAS/EC号 I文拉法辛盐酸盐 Venlafaxine HC 9300-78-4 2 O-去甲文拉法辛 O-Desmethylvenlafaxine 93413-62-8 3 米氮平 Mirtazapine 85650-52-8 4 帕罗西汀马来酸盐 Paroxetine maleate 64006-44-6 5 盐酸米那普仑 Milnacipran hydrochloride 101152-94-7 6 盐酸安非他酮 Bupropion hydrochloride 31677-93-7 7 羟基安非他酮 Hydroxy Bupropion 357399-43-0 8 盐酸舍曲林 Sertraline hydrochloride 79559-97-0 9 去甲盐酸舍曲林 (±)-Norsertraline hydrochloride 91797-57-8 10 草酸艾司西酞普兰 Escitalopram Oxalate 219861-08-2 11 西酞普兰 EP杂质D Citalopram Related Compound D 1188264-72-3 12 氢溴酸西酞普兰 Citalopram hydrobromide 59729-32-7 13 盐酸米安色林 Mianserin hydrochloride 21535-47-7 14 盐酸度洛西汀 Duloxetine hydrochloride 136434-34-9 15 马来酸氟伏沙明 Fluvoxamine maleate 61718-82-9 16 盐酸氯米帕明 Clomipramine hydrochloride 17321-77-6 17 去甲氯米帕明盐酸盐 Norclomipramine hydrochloride 303-48-0 18 盐酸阿米替林 Amitriptyline hydrochloride 549-18-8 19 去甲替林盐酸盐 Nortriptyline hydrochloride 894-71-3 20 氟西汀 Fluoxetine 54910-89-3 去甲氟西汀草酸盐 Norfluoxetine oxalate 107674-50-0 盐酸曲唑酮 Trazodone hydrochloride 25332-39-2 23 多塞平盐酸盐 Doxepin hydrochloride 1229-29-4 24 N-去甲多塞平 Nor-Doxepin 1225-56-5 表4 内标信息 # 中文名 英文名 CAS/EC号 文拉法辛-D， Venlafaxine-D， 1020720-02-8 2 O-去甲文拉法辛-D， (±)-O-Desmethylvenlafaxine-D。 1062605-69-9 3 米氮平-D Mirtazapine-D3 1216678-68-0 4 rac-帕罗西汀-DA盐酸盐 rac-Paroxetine-D4 Hydrochloride 1217683-35-6 5 米那普仑-D10盐酸盐 rac-Milnacipran-D10 Hydrochloride 1217977-03-1 6 安非他酮-D。盐酸盐 (±)-Bupropion-D， Hydrochloride 1189725-26-5 7 羟基安非他酮-D， Hydroxy Bupropion-D， 1216893-18-3 8 舍曲林-C， HCI (±)-Sertraline-c， Hydrochloride NA 9 去甲舍曲林--c，盐酸盐 Norsertraline-c， Hydrochloride NA 10 艾司西酞普兰-D，乙酸盐 (S)-Citalopram-D，Oxalate 1217733-09-9 11 去甲艾司西肽普兰-D rac Desmethyl Citalopram-D4Oxalate NA 12 西酞普兰草酸盐-DA Citalopram-D4Oxalate 219861-08-2 13 米安色林-D Mianserin-D 81957-76-8 14 度洛西汀-D Duloxetine-D- 919514-01-5 15 马来酸氟伏沙明-D Fluvoxamine-D3maleate 1185245-56-0 16 氯米帕明-D，盐酸盐 Clomipramine-D Hydrochloride 1190043-04-9 17 去甲氯米帕明-D：盐酸盐 N-Desmethylclomipramine-D3 Hydrochloride 1189971-04-7 18 阿米替林-D盐酸盐 Amitriptyline-D3 Hydrochloride 342611-00-1 19 去甲替林-D盐酸盐 Nortriptyline-D Hydrochloride 136765-48-5 20 氟西汀-D Fluoxetine-D： 200-659-6 21 草酸去甲氟西汀-D， Norfluoxetine-D，oxalate NA 22 曲唑酮-D，盐酸盐 Trazodone-D， Hydrochloride solution 1181578-71-1 23 多塞平-D，盐酸盐 Doxepin-D3 Hydrochloride 347840-07-7 24 N-去甲盐酸多塞平-D， Nor-Doxepin-D3Hydrochloride 1331665-54-3 1.3.2样本制备 (1)内标萃取液：分别移取内标储备液于 50 mL容量瓶中，加入乙腈溶液定容得到内标萃取液(各化合物浓度为 4~40 ng/mL) ； (2)校准品：分别移取标准品储备液于2mL容量瓶中，加入正常人血清定容得到7个浓度的人血清基质校准品(各化合物浓度如表5所示)； (3)质控品：分别移取标准品储备液于2mL容量瓶中，加入正常人血清定容得到2个浓度的人血清基质质控品5 ((各化合物浓度如表5所示)。 表5 校准品&质控品浓度信息 # 名称 校准品(ng/mL) 质控品(ng/mL) STD1 STD2 STD3 STD4 STD5 STD6 STD7 LQC HQC 1 文拉法辛 20 50 80 100 250 500 1000 40 800 2 O-去甲文拉法辛 20 50 80 100 250 500 1000 40 800 3 米氮平 4 10 16 20 50 100 200 8 160 4 帕罗西汀 4 10 16 20 50 100 200 8 160 5 米那普仑 8 20 32 40 100 200 400 16 320 安非他酮 50 125 200 250 625 1250 2500 100 2000 7 羟安非他酮 50 125 200 250 625 1250 2500 100 2000 8 舍曲林 8 20 32 40 100 200 400 16 320 9 去甲舍曲林 8 20 32 40 100 200 400 16 320 10 艾司西肽普兰 4 10 16 20 50 100 200 8 160 11 去甲艾司西肽普兰 4 10 16 20 50 100 200 8 160 12 西酞普兰 6 15 24 30 75 150 300 12 240 13 米安色林 4 10 16 20 50 100 200 8 160 14 度洛西汀 6 15 24 30 75 150 300 12 240 15 氟伏沙明 14 35 56 70 175 350 700 28 560 16 氯米帕明 12 30 48 60 150 300 600 24 480 17 去甲氯米帕明 12 30 48 60 150 300 600 24 480 18 阿米替林 8 20 32 40 100 200 400 16 320 19 去甲阿米替林 8 20 32 40 100 200 400 16 320 20 氟西汀 30 75 120 150 375 750 1500 60 1200 21 去甲氟西汀 30 75 120 150 375 750 1500 60 1200 22 曲唑酮 30 75 120 150 375 750 1500 60 1200 23 多塞平 1.3.3样本前处理 (1)移取30uL校准品/质控品/待测血清样本于1.5mL离心管； (2)加入120 uL内标萃取液于2000 rpm 涡旋混合1 min； ( 10000 rpm 4℃离心5 min； ) 21取 100 uL上清于进样小瓶并加入300 uL纯水混匀； (5)上机后自动进样器以4 uL进样分析。 实验结果 2.1临床参考区间 表6 临床参考区间 # 名称 有效浓度(ng/mL) 警戒浓度(ng/mL) 文拉法辛 100-400 800 2 O-去甲文拉法辛* 100-400 800 3 米氮平 30-80 160 4 帕罗西汀 20-65 120 5 米那普仑 100-150 300 6 安非他酮 850-1500 2000 7 羟安非他酮* 850-1500 2000 8 舍曲林 10-150 300 9 去甲舍曲林 10-150 10 艾司西肽普兰 15-80 11 去甲艾司西肽普兰* 15-80 12 西酞普兰 50-110 220 13 米安色林 15-70 140 14 度洛西汀 30-120 240 15 氟伏沙明 60-230 500 16 氯米帕明 230-450 450 17 去甲氯米帕明* 230-450 450 18 阿米替林 80-200 300 19 去甲阿米替林* 80-200 300 20 氟西汀 120-500 1000 21 去甲氟西汀* 120-500 1000 22 曲唑酮 700-1000 1200 多塞平 50-150 300 去甲多塞平* 50-150 300 注：数据来源于 AGNP 指南 (2017) 和 RECIPER 试剂盒，*代谢物参考区间同原药. 2.2线性关系 将6个标准浓度的校准品按1.3.3中前处理条件进行分析测定，以浓度比为横坐标，面积比为纵坐标，内标法制作校准曲线得到相关系数、线性范围和校准品准确度见表7。 表7 标准曲线参数(1/C²加权) # 名称 相关系数 线性范围 (ng/mL) 准确度(%) 文拉法辛 0.9995 20~1000 97.2~104.9 2 O-去甲文拉法辛 0.9997 20~1000 98.4~104.7 3 米氮平 0.9992 4~200 90.0~107.8 4 帕罗西汀 0.9958 4~200 88.1~110.9 5 米那普仑 0.9992 8~400 96.0~105.7 6 安非他酮 0.9986 50~2500 96.0~109.6 7 羟安非他酮 0.9992 50~2500 97.9~109.0 8 舍曲林 0.9995 8~400 93.9~103.2 9 去甲舍曲林 0.9958 8~400 90.7~114.1 10 艾司西肽普兰 0.9989 4~200 95.2~107.4 11 去甲艾司西肽普兰 0.9998 4~200 95.4~104.2 12 西酞普兰 0.9996 6~300 97.0~104.3 13 米安色林 0.9993 4~200 92.8~110.9 14 度洛西汀 0.9985 6~300 91.8~112.9 15 氟伏沙明 0.9992 14~700 93.7~105.2 16 氯米帕明 0.9983 12~600 93.4~108.6 17 去甲氯米帕明 0.9997 12~600 96.6~103.9 18 阿米替林 0.9994 8~400 93.7~105.8 19 去甲阿米替林 0.9996 8~400 89.5~106.1 20 氟西汀 0.9994 30~1500 87.5~110.7 21 去甲氟西汀 0.9972 30~1500 88.6~110.5 22 曲唑酮 0.9998 30~1500 97.2~102.7 23 多塞平 0.9995 8~400 93.9~107.3 24 去甲多塞平 0.9978 8~400 90.6~108.9 2.3精密度&准确度实验 本实验分别对低浓度和高浓度的正常人血清基质加标样(质控品)进行5次重复测定，精密度相对标准偏差范围分别在 1.52%~8.84% (LQC)和0.72%~10.59%(HQC)之间，准确度度相对标准偏差范围分别在-4.33%~11.13% (LQC) 和-9.43%~4.93%(HQC)之间，满足临床检测要求，数据结果见附录表8和表9。 表8LLQC精密度&准确度结果(n=5) # 名称 均值(ng/mL) %CV 理论值(ng/mL) %偏倚 1 文拉法辛 40.55 2.12 40 1.37 2 O-去甲文拉法辛 40.31 1.52 40 0.78 米氮平 7.89 3.16 8 -1.38 4 帕罗西汀 8.10 7.59 8 1.25 5 米那普仑 16.08 2.02 16 0.50 6 安非他酮 102.10 1.76 100 2.10 羟安非他酮 102.97 2.12 100 2.97 8 舍曲林 16.07 6.97 16 0.44 9 去甲舍曲林 16.93 8.21 16 5.81 10 艾司西肽普兰 7.95 2.28 8 -0.62 11 去甲艾司西肽普兰 8.22 4.62 8 2.75 12 西酞普兰 11.48 3.58 12 -4.33 13 米安色林 8.89 3.26 8 11.13 14 度洛西汀 12.17 8.84 12 1.42 15 氟伏沙明 28.51 2.02 28 1.82 16 氯米帕明 24.17 5.03 24 0.71 17 去甲氯米帕明 24.91 2.98 24 3.79 18 阿米替林 15.84 6.68 16 -1.00 19 去甲阿米替林 16.46 2.74 16 2.88 20 氟西汀 59.67 7.75 60 -0.55 21 去甲氟西汀 60.32 5.76 0.53 22 曲唑酮 58.26 2.68 -2.90 23 多塞平 16.27 2.52 16 1.69 24 去甲多塞平 15.76 6.57 16 -1.50 表9FHQC精密度 &准确度结果(n=5) # 名称 均值(ng/mL) %CV 理论值(ng/mL) %偏倚 文拉法辛 749.69 1.56 800 -6.29 2 0-去甲文拉法辛 763.68 1.61 800 -4.54 3 米氮平 156.56 2.77 160 -2.15 4 帕罗西汀 167.89 10.59 160 4.93 5 米那普仑 309.90 1.36 320 -3.16 6 安非他酮 1885.09 2.23 2000 -5.75 7 羟安非他酮 1966.08 0.72 2000 -1.70 8 舍曲林 313.34 3.47 320 -2.08 9 去甲舍曲林 329.82 9.55 320 3.07 10 艾司西肽普兰 154.09 1.73 160 -3.69 11 去甲艾司西肽普兰 161.30 2.04 160 0.81 12 西酞普兰 238.78 1.57 240 -0.51 13 米安色林 157.90 4.76 160 -1.31 14 度洛西汀 217.36 5.19 240 -9.43 15 氟伏沙明 560.71 1.38 560 0.13 16 氯米帕明 452.84 1.38 480 -5.66 17 去甲氯米帕明 462.23 2.02 480 -3.70 18 阿米替林 310.48 2.75 320 -2.97 19 去甲阿米替林 321.73 2.06 320 0.54 20 氟西汀 1143.83 1.50 1200 -4.68 21 去甲氟西汀 1182.31 1.54 1200 -1.47 22 曲唑酮 1145.83 1.85 1200 -4.51 23 多塞平 312.10 2.37 320 -2.47 24 去甲多塞平 306.82 2.77 320 -4.12 3.04e5 结论 建立了一种使用岛津质谱 LCMS-8045 测定人血清中24种抗抑郁药物的定量分析方法。利用蛋白沉淀的前处理方法，以内标法建立标准曲线，线性范围涵盖临床参考区间，分别考察了方法的线性、准确度和精密度性能。结果显示各分析物线性范围内标准曲线相关系数均大于0.9958，精密度相对标准偏差范围分别在1.52%~8.84% (LQC) 和0.72%~10.59%(HQC)之间，准确度度相对标准偏差范围分别在-4.33%~11.13%(LQC)和-9.43%~4.93%(HQC)之间，可满足临床日常检验需求。 岛津应用云 建立了一种使用岛津质谱LCMS-8045测定人血清中24种抗抑郁药物的定量分析方法。利用蛋白沉淀的前处理方法，以内标法建立标准曲线，线性范围涵盖临床参考区间，分别考察了方法的线性、准确度和精密度性能。结果显示各分析物线性范围内标准曲线相关系数均大于0.9958，精密度相对标准偏差范围分别在1.52%~8.84%（LQC）和0.72%~10.59%(HQC)之间，准确度度相对标准偏差范围分别在-4.33%~11.13%（LQC）和-9.43%~4.93%(HQC)之间，可满足临床日常检验需求。