培养基中C13标记柠檬酸含量检测方案(液质联用仪)

SSL-CA22-011Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-612 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS 法检测培养基C13；标记柠檬酸含量 LCMSMS-612 摘要：本文建立了一种使用岛津三重四极杆液质联用仪检测培养基内 C13标记的柠檬酸含量。该方法采用外标法定量，在1~500 ng/mL范围内，相关系数大于0.999。 LOQ 基质标液1 ng/mL连续6次进样保留时间RSD% 小于0.5%，峰面积的 RSD 为5.07%，仪器精密度良好。三个浓度样品加标回收率在97.90~106.80%之间，测试结果的 RSD 在1.14~3.26%之间，该方法稳定可靠，二2可为研究药物给药后，C个3标记柠檬酸转移摄入含量检测提供参考。 关键词：柠檬酸能量代谢 三重四极杆液质联用仪 三羧酸循环，又称柠檬酸循环盾 TCA 循环。在细胞线粒体内，，一系列酶促反应供能的系统。糖、蛋白、脂肪在分解代谢过程中都会产生乙酰 CoA，与草酰乙酸结合进入三羧酸循环，进而生成ATP，氧化供能。在三羧酸循环中，乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合生成含有3羧基的柠檬酸，柠檬酸再经过4次脱氢反应和磷酸化反应，最终生成CO，释放能量。在整个过程中，草酰乙酸和乙酰-CoA合成柠檬酸是三羧酸循环的重要调节点。通过定量检测三羧酸循环中各种中间有机酸含量，可用于靶向研究某些药物在治疗中是否参与到能量代谢，特别是抗癌药物的研究。通过影响或者控 制三羧酸循环功能的调节点，靶向给药进而抑制癌细胞的生长，达到抑制或者治疗作用。其中能量代谢中参与的有机酸小分子的定量研究具有重要的评估和参考价值。 由于柠檬酸等小分子有机酸属于内源性物质，内源性物质检测中会有基质干扰。为了消除内源性物质对分析带来的干扰，目前常采用同位素标记物进行培养，考察同位素标记的有机酸在培养前后的差异，表征摄入的情况。本文建立了一种采用三重四极杆液质联用仪检测 Cl3标记的柠檬酸培养基培养前后变化，表征在胞内摄入含量，可为于相关分析人员提供参考。 实验部分 1.1仪器 本实验采用岛津超高效液相色谱仪LC-40XR与三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用系统。 具体配置为： 系统控制器： CBM-40 输液泵：LC-40D XR×2 自动进样器： SIL-40CXR 柱温箱： CTO-40C 质谱仪： LCMS-8045 色谱工作站： LabSolutions Ver.5.99 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： ACE Excel 3 C18-AR(50mm×4.6mm×3.0um)； 流动相： A-0.02%氨水；B-乙腈 流速：0.25mL/min 柱温：40℃ 进样体积：10uL 洗针方式：外壁洗针 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为2%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 1.50 Pumps Pump B Conc. 2 1.80 Pumps Pump B Conc. 90 2.50 Pumps Pump B Conc. 90 2.60 Pumps Pump B Conc. 2 7.00 Controller Stop 质谱条件 离子化模式：ESI雾化气流速：3L/min加热模块温度：500℃DL温度：150℃ 接口温度：350℃干燥气流速：8L/min加热气流速：12L/min扫描模式：多反应监测(MRM) MRM 参数：见表 2 表2 MRM 参数 No. 中文名称 采集模式 前体离子 产物离子 Q1Pre Bias (V) CE(V) Q3 Pre Bias (V) 1 负 197.0 116.00* 13 13 20 柠檬酸C 90.00 21 18 15 *代表定量离子对。 1.3标准溶液制备 以20%乙腈水配制标准贮备液(1000 ug/mL)，并配置标准工作液0.1、0.2、0.5、1、2、5 ug/mL工作液、取 10 uL工作液加入990 uL的无C标记柠檬酸的培养基(基质空白)，加乙腈蛋白沉淀后，制备成1、2、5、10、20、50、100、200、500 ng/mL共9个标准系列基质标液，待测。 1.4样品前处理 将用添加药物和C标记的柠檬酸培养液，培养一定时间的 H22癌细胞，取培养后的培养基，经乙腈提取、沉淀蛋白后，12000 rpm 离心10 min， 取上清上机分析。 结果与讨论 2.1专属性 基质空白和基质标液 MRM 重叠谱图显示，目标峰保留时间处，未见明显干扰。 图1 基质空白和1.0ng/mL 基质对照溶液 MRM重叠色谱图 图2 标准曲线 2.2线性关系 按照1.3配制9个不同浓度的标准系列溶液，按照1.2中的分析条件进行测定。。以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标，外标法绘制标准曲线。各化合物标准曲线见图2，定量限为1ng/mL，信噪比为14.02， 准确度范围为 86%-104%。 2.3精密度实验 对三个浓度的基质标液1 ng/mL、连续6次进样，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的精密度结果如表4所示。保留时间 RSD%小于0.5%，峰面积的 RSD 为5.07%，仪器精密度良好。 Data# 数据文件名 级别号 保留时间 面积 浓度 (ng/mL) 精确度% 统计 1 1ng-基质-L0Q002.lcd 1 1.234 4，421 0.962 96.2 2 1ng-基质-LOQ003.lcd 1 1.236 4，618 0.980 98.0 3 1ng-基质-L0Q004.lcd 1 1.231 4，458 0.965 96.5 4 1ng-基质-L0Q005.lcd 1 1.241 4，366 0.956 95.6 5 1ng-基质-L0Q007.lcd 1 1.223 4.992 1.016 101.6 6 1ng-基质-L0Q008.lcd 1 1.235 4，459 0.965 96.5 平均 1.233 4，552 0.974 97.4 %RSD 0.499208 5.076110 2.263389 2.242091 最大 1.241 4，992 1.016 101.6 最小 1.223 4，366 0.956 95.6 标准偏差 0.006156 231.074227 0.022045 2.183745 图3精密度结果(n=6) 2.4加标回收实验 使用本方法检测了未添加C标记柠檬酸培养基溶液，在该培养基基质中添加标准溶液，配制为三个不同浓度的加标样品，每个浓度平行制备三份，按照1.4处理后上机分析，样品检测结果和加标回收结果见表5。三个浓度加标回收率在97.90~106.80%之间，测试结果的 RSD 在1.14~3.26%之间，方法可靠。 表5样品加标回收率(n=3) 化合物名称 基质空白ng/mL 1.0ng/mL 80ng/mL 400 ng/mL 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% 柠檬酸C3 N.D. 97.90 3.26 106.80 1.61% 102.50 1.14 注： N.D.表示未检出。 2.5残留考察 高浓度标准样品(500ng/m)分析完成后，进样分析溶剂空白，分析结果与定量下限(1ng/mL)比对，残留考察结果表明，柠檬酸C定量检测通道中无残留，结果见图4。 2.6样品检测 用该方法检测某抗癌药后，培养12h后细胞培养基C标基的柠檬酸含量，经计算含量为34.85 ng/mL，三针的 RSD%为 1.62%。三针样品色谱图见图5。 图4 残留考察溶剂空白和定量下限 MRM 重叠图 图5 样品检测的 MRM 色谱图 结论 本文建立了一种使用岛津三重四极杆液质联用仪 LCMS-8045 测定培养基中C3标记的柠檬酸含量的方法。该方法可快速准确的检测给药后培养基中C标记的柠檬酸含量变化，进而表征胞内转移的柠檬酸含量，可用于研究药物给药后，是否参与影响到细胞的能量代谢，为相关研究提供方法参考。 岛津应用云 本文建立了一种使用岛津三重四极杆液质联用仪LCMS-8045测定培养基中C13标记的柠檬酸含量的方法。该方法可快速准确的检测给药后培养基中C13标记的柠檬酸含量变化，进而表征胞内转移的柠檬酸含量，可用于研究药物给药后，是否参与影响到细胞的能量代谢，为相关研究提供方法参考。