食品中硝基咪唑残留量检测方案(固相萃取仪)

北京莱伯泰科仪器股份有限公司Beijing LabTech Instruments Co.，Ltd 解决方案|动物源性食品中的硝基咪唑残留量检测 前言 近年来，动物制品中的兽药严重超标，不仅对人体产生急性或慢性中毒作用，引起致病原耐药性显著增强，还可通过各种环境和食物链，间接对人体的生命财产安全造成危害。为此，当前做好动物源性食品中多种兽药残留的检测刻不容缓。 硝基咪唑类药物是一 类常用抗菌类药物，常见的有甲硝唑、洛硝哒唑、地美硝唑、替硝唑、羟甲基甲硝咪唑等，使用此类药物对动物体重还具有增加作用，因此在畜禽养殖中被广泛违法使用。有研究表明，硝基咪唑类药物和其代谢物具有致突变和致癌性，禽类肉和蛋制品中的硝基咪唑类药物残留对消费者健康构成直接威胁。 本实验参考 《GB/T 21318-2007 动物源食品中硝基咪坐残留量检验方法》，利用莱伯泰科 MVP 全自动高通量真空平行浓缩仪进行浓缩， GPC 1000 全自动凝胶净化系统进行净化， SPE 1000 全自动固相萃取系统进行富集，采用LC-MS/MS检测样品，建立了一套检测肉制品中的硝基咪唑前处理方案，此方案的 回收率及平行性良好，适合动物源食品中硝基咪唑残留量的检测。 关键词：食品安全 固相萃取 浓缩 凝胶净化硝基咪唑 一、仪器与试剂 GPC 1000 全自动凝胶净化系统(莱伯泰科)； MVP全自动高通量真空平行浓缩仪(莱伯泰科)； SPE 1000 全自动固相萃取系统(莱伯白科)； 液质联用仪： SCIEX Exion LCTM液相系统+ Triple QuadTM 4500 质谱系统(SCIEX公司) 10种硝基咪唑标准使用液：： 10pg/mL， 溶剂体系为甲醇； 甲醇、甲酸、乙酸乙酯、丙酮、环己烷(色谱纯， Fisher公司)； 氯化钠、无水硫酸钠、硅藻土(分析纯，国药集团)； C18固相萃取柱：1000mg/6mL(莱伯泰科)。 二、实验过程 1、样品提取 精密称取市售羊肉制品20g， 加入 10g硅藻土，混匀，再加入5mL饱和氯化钠水溶液和 70mL甲醇-丙酮(3+1)，均质3 min， 后续在10000r/min 条件下离心2min，收集上清液，样品残渣用50mL 甲醇-丙酮(3+1)重复提取两次，合并提取液。 将提取液置于 MVP 全自动高通量真空平行浓缩仪上按温度38℃、转速150rpm、真空度 120mbar浓缩至仅剩水相，加入50mL 饱和氯化钠水溶液和25mL乙酸乙酯，振摇 3min， 分层后收集乙酸乙酯相，水相再用20mL乙酸乙酯重复提取两次，合并乙酸乙酯提取液，经无水硫酸钠除水，于 MVP 全自动高通量真空平行浓缩仪上按温度36℃、转速 150rpm、真空度 250mbar浓缩近干，用乙酸乙酯-环己烷(1+1)定容至5mL， 待净化。 2、凝胶净化 凝胶净化柱采用 Bio-Beads SX3， 20×300mm；流动相采用乙酸乙酯-环己烷(1+1)；使用 GPC 1000 全自动凝胶净化系统按照图1方法对过程1中提取液进行净化，收集净化液，于 MVP 全自动高通量真空平行浓缩仪按按温度36℃、转速150rpm、真空度250mbar浓缩近干，用甲醇定容至 5mL， 待后续处理。 图1GPC1000凝胶净化方法流程 3、固相萃取 将过程2中的净化液加入 SPE 1000 全自动固相萃取系统按照图2方法进行固相萃取富集，洗脱液加入 MVP 全自动高通量真空平行浓缩仪按温度38℃、转速 150rpm、真空度120mbar 浓缩近干，用甲醇定容至1mL， 经 0.22um滤膜过滤后，待上机检测。 图2 SPE1000固相萃取方法流程 4、加标回收率测定 按照前述的方法准备样品，在样品中分别按 1ng/g、4ng/g 的标品浓度加入一定体积的10种硝基咪唑标准使用液，最后得到到标样品待上机检测。 5、标曲配制 制备6份阴性样品溶液，按照最终定容浓度0、10、20、50、100、500ng/mL分别加入10种硝基咪唑标准使用液，上机检测。 三、LC-MS/MS测定条件 a) 色谱柱： Shim-pack Velox C18 (2.7pum， 2.1*100mm)； b)柱温：40℃； c) 进样量： 5pL； d)流动相： A：0.1%甲酸水溶液，B：甲醇(梯度洗脱程序见表1)； e)流速： 0.40mL/min； f)离子源参数： IS电压：5500V； 气帘气 CUR： 30 psi；i；雾零化气 GS1： 50 psi； 辅助气GS2： 60 psi；离子源温度 TEM：600℃；碰撞气CAD：9 psi； g)检测方式：正离子模式，，多反应监测(MRM)。 表1梯度洗脱程序 时间(min) 流速(mL/min) 比例B(%) 0 0.4 10.0 3.50 0.4 30.0 4.50 0.4 30.0 6.40 0.4 75.0 6.50 0.4 95.0 8.20 0.4 95.0 8.21 0.4 10.0 9.50 0.4 10.0 四、测定结果 1、10种硝基咪唑色谱图 图310种硝基咪唑 GPC 色谱图 图410种硝基咪唑LC-MS/MS色谱图 图5羊肉样品LC-MS/MS色谱图 图6样品加标LC-MS/MS色谱图 2、110种硝基咪唑线性 10种硝基咪唑校准曲线线性良好，R²在 0.998-0.9999之间，见图7。 图710种硝基咪唑标准曲线 3、加标回收率 经过前处理后的10种硝基咪唑的加标测试，经LC-MS/MS 分析得到回收率结果见表2。 表2 羊肉加标回收率结果 化合物 加标浓度 加标回收率/% 均值 RSD ng/g 1 2 3 4 5 6 % % 4-硝基咪唑 92.7 95.2 89.5 88.0 79.8 82.3 87.9 6.8 异丙硝唑 79.8 96.7 91.6 96.9 82.1 84.5 88.6 8.4 甲硝唑 78.6 74.7 77.3 84.9 69.7 72.4 76.2 7.0 羟基化甲硝咪唑 80.4 92.9 79.9 94.6 99.9 77.7 87.6 10.7 氯甲硝咪唑 92.3 91.9 84.8 87.6 97.3 98.0 92.0 5.7 地美硝唑 90.7 76.4 88.3 96.0 75.7 94.0 86.8 10.1 HMMNI 82.8 86.5 82.9 84.8 91.1 77.3 84.3 5.4 2-甲硝咪唑 86.0 89.3 86.7 86.7 91.0 87.8 87.9 2.1 洛硝哒唑 87.1 94.0 100.4 87.1 95.8 93.8 93.0 5.6 苯硝咪唑 99.0 86.4 92.8 97.6 95.0 92.3 93.8 4.8 4-硝基咪唑 4 81.9 81.2 91.0 88.8 83.8 85.2 85.3 4.5 异丙硝唑 4 78.5 94.1 87.6 91.2 82.6 86.1 86.7 6.5 甲硝唑 4 91.7 83.5 83.8 83.0 81.6 85.7 84.9 4.2 羟基化甲硝咪唑 4 92.3 83.2 81.4 81.8 86.1 87.1 85.3 4.8 氯甲硝咪唑 4 83.0 87.3 83.9 77.4 85.4 79.7 82.8 4.4 地美硝唑 4 88.8 86.9 95.4 79.5 87.5 81.0 86.5 6.6 HMMNI 4 87.9 85.2 79.7 88.3 87.3 76.6 84.2 5.8 2-甲硝咪唑 4 93.8 98.4 94.1 89.2 80.8 78.1 89.1 9.1 洛硝哒唑 4 83.4 83.0 85.3 82.9 81.7 83.2 83.2 1.4 苯硝咪唑 4 66.8 76.4 64.4 78.3 67.7 74.1 71.3 8.0 五、结果与讨论 本方法采用莱伯泰科 SPE 1000全自动固相萃取系统、GPC 1000 全自动凝胶净化系统和 MVP 全自动高通量真空平行浓缩仪进行羊肉中的10种硝基咪唑净化、富集和浓缩实验， 通过 LC-MS/MS 分析得到样品的加标回收情况，加标回收率结果在71.3%-93.8%之间， RSD 在1.4%-10.7%之间，实验结果满意。 六、实验过程中莱伯泰科前处理设备优点总结 SPE 1000 全自动固相萃取系统可实现最多八个样品同时上样，双机械臂双针结构无上样管路交叉污染，确保实验结果准确度和可重复性； > GPC 1000 全自动凝胶净化系统满足样品通量大的需求，最多可支持 130位样品连续凝胶净化，无需其他手动操作，采用高效不锈钢凝胶净化柱，在满足方法要求的前提下，缩短收集时间，减少溶剂浪费； > MVP 全自动高通量真空平行浓缩仪不仅实现了高通量样品同时浓缩，节省人力，提高实验效率，而且针对不同实验步骤中的样品溶液，还可以通过适配器来满足不同体积样品的浓缩需求。 > GPC 1000、SPE1000 的样品收集架在 MVP 上均可以兼容使用，既减少样品转移过程中的损失，也使实验操作更加快速便捷。 本实验中采用的凝胶净化、固相萃取以及浓缩方法简便、快速，回收率满足要求，适用于食品中硝基咪唑的检测分析。 参考文献： GB/T 21318-2007 动物源食品中硝基咪唑残留量检验方法 尹青春，谭高好，邓浩，潘永波，张容，徐彬.UPLC-MS/MS法测定鸡蛋中17种硝基咪唑类药物及代谢物[J].食品工业，2021，42(04)：483-487. 殷圣洁，肖伟，李金娟.动物源性食品中多种兽药残留检测研究进展[J].畜牧业环境，2020(06)：12. 前言：近年来，动物制品中的兽药严重超标，不仅对人体产生急性或慢性中毒作用，引起致病原耐药性显著增强，还可通过各种环境和食物链，间接对人体的生命财产安全造成危害。为此，当前做好动物源性食品中多种兽药残留的检测刻不容缓。硝基咪唑类药物是一类常用抗菌类药物，常见的有甲硝唑、洛硝哒唑、地美硝唑、替硝唑、羟甲基甲硝咪唑等，使用此类药物对动物体重还具有增加作用，因此在畜禽养殖中被广泛违法使用。有研究表明，硝基咪唑类药物和其代谢物具有致突变和致癌性，禽类肉和蛋制品中的硝基咪唑类药物残留对消费者健康构成直接威胁。本实验参考《GB/T 21318-2007 动物源食品中硝基咪唑残留量检验方法》，利用莱伯泰科MVP全自动高通量真空平行浓缩仪进行浓缩，GPC 1000全自动凝胶净化系统进行净化，SPE 1000全自动固相萃取系统进行富集，采用LC-MS/MS检测样品，建立了一套检测肉制品中的硝基咪唑前处理方案，此方案的回收率及平行性良好，适合动物源食品中硝基咪唑残留量的检测。关键词：食品安全  固相萃取  浓缩  凝胶净化  硝基咪唑