污水中常见毒品及代谢物检测方案(液相色谱仪)

使用安捷伦在线固相萃取技术结合液相色谱-串联四极杆质谱分析污水中常见毒品及代谢物 李文彦，霍茵，马浩 本文采用安捷伦伦线固相萃取技术结合液相色谱-三重四极杆质谱系统 (6470B)测定污水中的0°-单乙酰吗啡、吗啡、甲基苯丙胺、苯丙胺、氯胺酮、去甲氯胺酮、3，4-亚甲二氧基甲基苯丙胺 (MDMA)、3，4-亚甲二氧基苯丙胺 (MDA)、可卡因、苯甲酰爱康宁、可待因、美沙酮、四氢大麻酸等13种毒品及代谢物。该方法简化了样品前处理步骤，有助于提升工作效率。除四余大麻酸(对照品可能发生降解)定量下限为 1.95 ng/L外，所考察的其余化合物的定量下限均低于1 ng/L， 且真实污水样品的加标回收率为81.0%-111.1%，满足行业分析中的测定要求。 “污水验毒”源于“污水流行病学”，即通过对特定区域生活污水中毒品及其代谢物含量进行抽样检测，结合污水水质参数和该污水处理覆盖人口数量，推算出该区域吸毒人群规模、吸食毒品种类、有无制毒窝点等，进而科学评估估区域毒情形势"。 当前污水中常规待测毒品为0°-单乙酰吗啡、吗啡、甲基苯丙胺、苯丙胺、氯胺酮、去甲氯胺酮、3，4-亚甲二氧基甲基苯丙胺、3，4-亚甲二氧基苯丙胺、可卡因和苯甲酰爱康宁共10种。样品前处理一般采用离线固相萃取方法。该方法利用离子交换原理将待测物吸附于萃取小柱，经简单淋洗杂质后，在碱性条件下洗脱目标物，经氮吹、浓缩、复溶后测定。整个流程步骤繁琐，对技术人员操作水平要求较高，测定重现性较难保证。并且该样品前处理方法采用的阳离子交换固相萃取柱较适合提取生物碱类化合物，对大麻酚、大麻酸类化合物效果较差，局限性明显。 本文采用安捷伦在线固相萃取方案，结合 Agilent 6470B 三重四极杆质谱系统，在中性条件下完成样品加载，然后通过阀切换将固相萃取柱上的目标物转移至分析柱，进行分离和测定。该方法适用范围广、可扩展性强、灵敏度高、重现性好，且大幅减少了人工干预，有助于提升分析效率并缩减时间成本。 试剂和样品 所有标准品均来自司法检测中心，纯度未标示，按100%计；质谱用甲酸购自CNW公公； 质谱用甲醇、乙腈、异丙醇购自Merck 公司 (Kenilworth， USA)。水由 Milli-Q超纯水系统制得。 磷酸二氢钾、磷酸氢二钾为分析纯，购自广州化学试剂厂。磷酸盐缓冲液以磷酸二氢钾及磷酸氢二钾制备， pH7.2。 色谱柱及耗材 在线固相萃取柱为Oasis HLB Direct Connect HP 2.1×30mm，20 pm。 分析柱为 Agilent Poroshell 120 EC-C18， 3.0×100 mm， 2.7 pm(部件号695575-302)。 Agilent 1290 Infinity ⅡI在线过滤器，0.3 pm(部件号5067-6189)。 仪器和设备 Agilent 1290 Infinity ll液相色谱系统，配备如下安捷伦组件： 二元泵(部件号G7120A) -自自动液体进样器(部件号 G7167B)，安装900 pL大体积计量泵及500pL大体积定量环 -柱温箱(部件号 G7116B)，含内置阀驱动，加载2位10通阀 Agilent 1260 Infinity lI Prime 四元泵(部件号G7104C)。 Agilent 6470B 三重四极杆质谱系统。 校准标样配制 13种混合待测物标准溶液(浓度为125 pg/L))1以磷酸盐缓冲液(pH 7.2)逐级稀释，分别制得含吗啡(Morphine)、甲基苯丙胺 (MAMP)、苯丙胺(AMP)、氯胺酮 (Ketamine)、去甲氯胺酮 (Norketamine)、3，4-亚甲二氧基甲基苯丙胺(MDMA)、可卡因 (Cocaine)、苯甲酰爱康宁 (Benzoylecgonine)、美沙酮 (Methadone) 0.12 ng/L 至500 ng/L、含0°-单乙酰吗啡(0°-Acetylmorphine)、可待因 (Codeine) 0.24 ng/L 至500 ng/L、含3，4-亚甲二氧基苯丙胺 (MDA) 0.98 ng/L 至 500 ng/L 和含四氢大麻酸(THC-COOH) 3.9 ng/L 至500 ng/L的系列标准溶液。 13种混合内标溶液(浓度25pg/L)以磷酸盐缓冲液 (pH 7.2)逐级稀释，制得浓度为25 ng/L 的混合内标溶液。 将上述系列混合待测物标准溶液分别加入等体积混合内标溶液(25ng/L)中，制得各化合物最终浓度如下的系列混合标准溶液：吗啡、甲基苯丙胺、苯丙胺、氯胺酮、去甲氯胺酮、3，4-亚甲二氧基甲基苯丙胺、可卡因、苯甲酰爱康宁、美沙酮分别为0.06 ng/L至250 ng/L， 0-单乙酰吗啡、可待因分别为 0.12 ng/L至 250 ng/L， 3，4-亚甲二氧基苯丙胺为 0.49 ng/L 至 250 ng/L，四氢大麻酸为 1.95 ng/L 至250 ng/L，且其中内标最终浓度为12.5 ng/L。精密量取上述混合标准溶液各500pL， 注入液质联用系统进行分析。以相对内标的系列浓度作为横坐标，待测物及内标响应比值作为纵坐标，绘制各化合物的标准工作曲线。 样品前处理及测定 取污水适量，去除不溶性杂质后，以磷酸盐缓冲溶液 (pH7.2)调整 pH至中性；向其中加入内标混合溶液，使内标最终浓度为12.5 ng/L；涡旋混匀，精密量取 500pL， 注入液质联用系统进行分析。 液相色谱条件 在线固相萃取富集条件见表1。 表1.在线固相萃取富集条件 1260 Infinity Il Prime 液相色谱条件：在线固相萃取富集条件 固相萃取柱 Oasis HLB Direct Connect HP， 20 pm，2.1x30 mm 进样体积 500pL 流动相 A：水 B：5%甲醇水溶液 C： 50%甲醇水溶液(含0.1%甲酸) D：甲醇：异丙醇(1：1) 流速 见下表(mL/min) 时间(min) A% B% C% D% 流速 0.00 100 0 0 0 0.5 0.01 0 100 0 0 3.0 2.80 0 100 0 0 3.0 2.84 0 100 0 0 3.0 2.85 0 0 100 0 2.0 液相梯度 5.00 0 0 100 0 2.0 5.01 0 0 0 100 2.0 10.00 100 0 0 100 2.0 10.01 100 0 0 0 2.0 15.00 100 0 0 0 2.0 15.01 100 0 0 0 0.5 20.00 100 0 0 0 0.5 分析柱洗脱条件见表2。 6470B三重四极杆质谱仪离子源参数见表3。 表2.分析柱洗脱条件 表3.6470B三重四极杆质谱仪离子源参数 1290 Infinity ll液相色谱条件：分析先洗脱条件 分析柱 Agilent Poroshell EC-C18， 3.0×100 mm， 2.7 pm 色谱柱柱温 40°C 流动相 A：水(含0.1%甲酸+2 mmol/L甲酒铵) B： ACN(含0.1%甲酸) 流速 0.4 mL/min 液相梯度 时间(min) B% 0.0 5 5.0 6.0 5159.0 5510.0 8515.0 8515.1 100 20 100 停止时间 20 min 后运行时间 5 min 离子源参数 离子化模式 正/负 干燥气温度 300°℃ 干燥气流速 8 L/min 雾化气压力 45 psi 鞘气温度 375°C 鞘气流速 12L/min 毛细管电压 3500V(正) /3000V(负) 喷嘴电压 500V(正) /1000V (负) 阀切换时间：2.8min (切换至下一阀位) 13种毒品及代谢物质谱采集所用的 dMRM 离子对参数见表 4。 表4.13种毒品及代谢物 dMRM离子对列表 化合物名称 母离子(m/z) 子离子 (m/z) 碎裂电压(V) 碰撞能量(V) 碰撞池加速电压(V) 极性 保留时间(min) 苯丙胺 136.1 119 70 6 3 正 8.1 苯丙胺 136.1 91 70 22 3 正 8.1 苯丙胺 136.1 65 70 40 3 正 8.1 苯丙胺-D5 141.1 124 70 6 3 正 8.07 苯丙胺-D5 141.1 93 70 22 3 正 8.07 苯甲酰爱康宁 290.1 168 120 22 3 正 8.46 苯甲酰爱康宁 290.1 105 120 34 3 正 8.46 苯甲酰爱康宁-D3 293.1 171 120 22 3 正 8.46 苯甲酰爱康宁-D3 293.1 105 120 34 3 正 8.46 可卡因 304.1 182.1 120 22 3 正 9.04 可卡因 304.1 150.1 120 30 3 正 9.04 可卡因-D3 307.1 185.1 120 22 3 正 9.04 可卡因-D3 307.1 153.1 120 30 3 正 9.04 可待因 300.2 199.1 166 35 3 正 7.84 可待因 300.2 165.1 166 40 3 正 7.84 可待因 300.2 128.1 166 60 3 正 7.84 可待因-D6 306.2 202.1 166 25 3 正 7.82 可待因-D6 306.2 165.1 166 40 3 正 7.82 氯胺酮 238 207 80 15 3 正 8.51 氯胺酮 238 179 80 18 3 正 8.51 注：部分化合物的 MRM 离子对多于2对，方便在发生基质干扰时酌情选择。 色谱分离结果 本方法可在12分钟内完成对13种毒品及代谢物的分离，分离效果见图1。 图1.13种毒品及代谢物的 dMRM 色谱图(250 ng/L，纵坐标为相对虽度)各个峰分别对应：1.吗啡；2.可待因；3.苯丙胺；4.0°-单乙酰吗啡；5.3，4-亚甲双氧苯丙胺；6.甲基苯丙胺；7.3，4-亚甲双氧甲基苯丙胺；8.去甲氯胺酮；9.苯甲酰爱康宁；10.氯胺酮；11.可卡因；12.美沙酮；13.四氢大麻酸 定量限和线性范围结果 使用 Agilent 6470B 三重四极杆质谱仪可实现对13种毒品及代谢物的超低浓度检测，方法定量限见表5。 表5.13种毒品及代谢物的定量限 化合物名称 定量限(ng/L) 苯丙胺 0.06 苯甲酰爱康宁 0.06 可卡因 0.06 可待因 0.12 氯胺酮 0.06 甲基苯丙胺 0.06 3，4-亚甲双氧苯丙胺 0.49 3，4-亚甲双氧甲基苯丙安 0.06 美沙酮 0.06 吗啡 0.06 去甲氯胺酮 0.06 O6-单乙酰吗啡 0.12 四氢大麻酸 1.95 13种目标分析物的标准曲线回归方程、线性范围、线性相关系数以及测定准确度等结果见表6，各目标分析物在标准曲线浓度范围内，相关系数均R'>0.99，标准曲线测定准确度在82.6%至115.6%之间，线性良好。 化合物名称 标准曲线 范围(ng/L) 准确度(%) 相关系数R? 苯丙胺 y=0.795711*x-0.001229 0.06-250 83.1-109.7 0.9922 苯甲酰爱康宁 y=1.115657*x-1/997565E-006 0.06-250 84.1-110.7 0.9907 可卡因 v=1.000332*x+0.001509 0.06-250 85.3-108.8 0.9936 可待因 y=1.101309*x+0.003295 0.12-250 85.0-113.7 0.9919 氯胺酮 y=1.066963*x+0.005065 0.06-250 82.6-108.4 0.9920 甲基苯丙胺 y=1.787043*x-5.837238E-004 0.06-250 92.7-108.2 0.9975 3，4-亚甲双氧苯丙胺 v=0.573174*x-2.451893E-004 0.49-250 91.7-109.8 0.9946 3，4-亚甲双氧甲基苯丙按 y=0.935742*x-3.442774E-004 0.06-250 87.7-115.6 0.9910 美沙酮 v=0.935696*x-7.984310E-006 0.06-250 89.6-108.7 0.9951 吗啡 v=1.125109*x-7.112125E-004 0.06-250 93.3-110.0 0.9972 去甲氯胺酮 y=0.980098*x+7.787186E-004 0.06-250 85.1-108.2 0.9940 06-单乙酰吗啡 y=1.058300*x-0.004210 0.12-250 90.2-106.5 0.9957 四氢大麻酸 y=4.277512*x-0.253051 1.95-250 94.6-112.1 0.9946 精密度实验结果 实际样品测定及加标回收实验结果 取低、中、高三个浓度水平的混合标准溶液连续进样6次，考察仪器精密度。结果表明，13种目标分析物的检测结果峰面积RSD%均在8.9%以内，表明精密度良好(详见表7)。 实际样品为湖南某地污水样品。取适量样品，按照上文所述的样品前处理及测定方法平行测试三次，结果见表8. 表7.仪器精密度测试结果 取上述污水样品适量，去除不溶性杂质后，分别添加低、中、高三浓度水平混合标准溶液，按照上文所述的样品前处理及测定方法，将每个浓度水平的样品平行配制三份并分别进样测定，计算平均回收率，结果如表8所示。数据结果表明13种目标物质三个浓度水平下加标回收率均在 81.0%-111.1%之间，回收率良好，方法准确度高。 化合物名称 3.9 ng/L RSD% 31.25ng/L RSD% 125 ng/L RSD% 吗啡 2.9 1.8 2.5 可待因 7.5 7.7 8.9 苯丙胺 2.3 1.1 2.5 06-单乙酰吗啡 4.4 4.4 3.5 3，4-亚甲双氧苯丙胺 5.7 3.6 4.5 甲基苯丙胺 3.0 1.9 1.7 3，4-亚甲双氧甲基苯丙胺 7.4 6.0 6.3 去甲氯胺酮 3.6 4.4 4.3 氯胺酮 2.1 2.4 3.7 苯甲酰爱康宁 4.3 1.2 2.1 可卡因 2.6 1.8 2.0 美沙酮 1.1 1.9 2.8 四氢大麻酸 6.6 4.7 5.2 表8.样品加标回收率测试 化合物名称 样品 测试浓度(ng/L) 样品加标12.5ng/L 测试式度(ng/L) 样品加标12.5 ng/L 回收率(%) 样品加标 31.25 ng/L测试浓度(ng/L) 样品加标31.25ng/L样品加标125 ng/L 回收率(%) 测试浓度(ng/L) 样品加标125ng/L 回收率(%) 吗啡 ND 12.01 96.1 29.59 94.7 128.3 102.6 可待因 ND 12.98 103.8 32.67 104.5 138.9 111.1 苯丙胺 ND 12.53 100.2 31.01 99.2 130.3 104.2 06-单乙酰啡 ND 10.13 81.0 26.02 83.3 106.4 85.1 3，4-亚甲双氧苯丙胺 ND 11.95 95.6 29.94 95.8 127.1 101.6 甲基苯丙胺 10.39 22.80 99.3 42.21 101.8 138.5 102.5 3，4-亚甲双氧甲基苯丙胺 ND 12.82 102.6 32.16 102.9 132.8 106.2 去甲氯胺酮 0.994 12.73 93.9 31.15 96.5 127.4 101.1 氯胺酮 5.631 19.01 107.0 37.92 103.3 138.6 106.4 苯甲酰爱康宁 ND 13.02 104.2 32.08 102.7 134.5 107.6 可卡因 ND 12.37 99.0 31.52 100.9 133.3 106.6 美沙酮 0.6302 13.17 100.3 34.68 109.0 137.9 109.8 四氢大麻酸 ND 13.10 104.8 29.69 95.0 132.1 105.6 注：样品中化合物的检测浓度低于 0.5 ng/L， 无监测意义，按照未检出计。 本文使用在线固相萃取结合安捷伦液相色谱-三重四极杆质谱系统(6470B) 对污水中的13种毒品及代谢物进行测定。该方法使用内标法绘制标准曲线，各化合物获得了良好的线性相关性。在精密度实验中，取低、中、高三个浓度水平的混合标准溶液连续进样6次，所得 RSD<8.9%，表明系统具有出色的重现性。在准确度测试中，低、中、高三种浓度下的回收率在 81.0%-111.1%之间，表明测定结果准确可靠。总之，该方法操作简单、方便快捷，结果灵敏度高、准确度度色；其采用双 SPE柱交替上样，有助于提高分析效率并降低实验室运营成本，可以满足基质复杂、目标物检测浓度为 ng/L 级别的实际污水样品分析测试需求。 ( X iqing L i， Peng Du and Wei Zhang. Application of Wastewater-Based Epidemiology in China-From Wastewater Monitoringto Drug Control Efforts， Wastewater-Based Epidemiology：Estimation of Community Consumption of Drugs and Diets，American C h emical So c iety， Washington， D.C.， 2019： Chapter 6， pp119-135 ) 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 ( 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ) ( @安捷伦科技(中国)有限公司，2021 ) ( 5994-4169ZHCN ) 本文采用安捷伦在线固相萃取技术结合液相色谱-三重四极杆质谱系统 (6470B) 测定污水中的 O6-单乙酰吗啡、吗啡、甲基苯丙胺、苯丙胺、氯胺酮、去甲氯胺酮、3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺 (MDMA)、3,4-亚甲二氧基苯丙胺 (MDA)、可卡因、苯甲酰爱康宁、可待因、美沙酮、四氢大麻酸等 13 种毒品及代谢物。该方法简化了样品前处理步骤，有助于提升工作效率。除四氢大麻酸（对照品可能发生降解）定量下限为 1.95 ng/L 外，所考察的其余化合物的定量下限均低于 1 ng/L，且真实污水样品的加标回收率为81.0%–111.1%，满足行业分析中的测定要求。