血清中万古霉素检测方案(液相色谱仪)

thermoscientific Online-SPE法测定血清中抗生素类药物万古霉素的含量 殷承华，赛默飞世尔科技(中国)有限公司施磊，华东理工大学 关键词： Vanquish Core，抗生素类药物，万古霉素，治疗药物监测 (TDM)，Online-SPE 万古霉素(Vancomycin， VCM) 是支链的三环糖基化非核糖体肽，可直接作用于细菌细胞壁前体羧基末端的D-丙氨氨-D-丙氨酸，抑制细胞壁蛋白的合成，革兰阳性菌对万古霉素敏感，因此对VCM对该类细菌有较强的杀菌作用，所以，它是目前治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-Resistant StaphylocOc-CUS aureus，MRSA)和耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)等所致重症感染的首选抗生素，在临床治疗学上占据重要地位。临床上常常进行静脉给药全身应用万古霉素以治疗敏感菌感染，但这种用药方式经常损害人体肝脏、肾脏等重要组织器官，造成比较严重的副反应。传统上，万古霉素被用作“最后一线药物”，用来治疗所有抗生素均无效的革兰氏阳性菌的严重感染。因此，为个体化给药方案提供理论依据，避免给危重病人带来更加严重的副反应，实现万古霉素的准确定量的意义重大。 由于每个个体之间年龄、性别、健康状况等都存在差异性，会导致患者体内万古霉素的血药浓度的个体间偏差较大。而通过治疗药物监测 (Therapeutic drug monitoring， TDM)可以帮助医生制定个体化用药方案。给药时，剂量将依据患者的血液浓度作调整，使患者在不良反应风险较小的条件下获得较好的疗效。给药期间定时监测血药浓度有助于降低不良反应发生的风险。当患者病情得到较好的控制而血药浓度过高，可以根据医嘱相应地减低剂量，降低不良反应风险；若患者病情不能得到控制，血药浓度的结果还可以帮助医生调整用药剂量，以获得更好的疗效。 方法介绍及优势 本文在新款智能Vanquish Core双三元液相系统上开发Online-SPE自动化样品前处理的液相色谱分析方法，用于精准监测血清中万古霉素含量。该方法具有灵敏度高、重现性好、耗时短等特点。从万古霉素的线性范围、重复性测试，到血清的加标测试，对血清中的万古霉素进行了完整的定量分析，系统地为临床个性化、更精准、更合理、更安全地用药提供一定的依据，提升临床的药物依从性，给患者提供更好的疗效。 1.实验部分 1.1仪器与试剂 1.1.1 Thermo Vanquish Core 高效液相色谱系统 Vanquish Core DGLC高效液相色谱系统包括带在线脱气单元的双三元梯度泵、等度泵、自动进样器(1000pL进样环)、柱温箱(含一个Viper Only 2p-6p切换阀)和DAD检测器(含13pL流通池；CDS变色龙色谱软件版本为7.2.10。 1.1.2试剂及标准品 乙腈、甲醇(色谱级， Fisher公司)，去离子水(18.2MQ， Millipore纯水机)，磷酸(分析纯AR，国药集团)，盐酸万古霉素96.5%， DR. EHRENSTORFER) 1.1.3样品溶液制备 标样的配制：用水溶解，配置万古霉素储备液100 mg/L，并用50%甲醇水稀释至需要浓度的溶液。 加标血清制备：用用液枪准确吸取1000 pL空白血清，分别加入适量万古霉素稀释标准溶液，配置成需要浓度的加标血样。 血液样品的配配：准确吸取1.00 mL血清于10 mL离心管中，加入3mL沉淀试剂，涡旋混合20 s， 12000 r/min下离心10 min，取上层清液过0.22 um水相膜加入进样小瓶，等待进样。 1.2色谱条件 1.2.1管路连接方式 图1流路连接图 1.2.2色谱分析条件 色谱柱：Thermo Hypersil GOLDTM a色谱柱(150mm*4.6mm， 5pm) 萃取柱： SPE TDM专用柱(重庆大学药学院合作实验室提供)柱温：30℃； DAD：检测波长210 nm DGLC左泵(分析泵)流动相A：乙腈，流动相B：11000 m水溶液(50uL磷酸) 表1.DGLC左泵流动相洗脱程序 时间/min 流速/mL·min-1 A% B% 0.0 1.000 15 85 5.5 1.000 15 85 8.0 1.000 40 60 11.5 1.000 40 60 14.0 1.000 15 85 17.0 1.000 15 85 DGLC右泵(萃取泵)流动相A：乙腈，流动相B：1000 mL水溶液(50uL磷酸)。 表2.DGLC右泵流动相洗脱程序 时间/min 流速/mL·min-1 A% B% 0.0 0.400 5 95 4.5 0.400 5 95 4.7 1.000 30 70 10.0 1.000 30 70 13.0 0.400 5 95 15.0 0.400 5 95 辅助泵(稀释泵)流动相A：纯水 表3.DGLC辅助泵流动相洗脱程序 时间/min 流速/mL·min1 A% 0.0 1.200 100 4.0 1.200 100 4.2 0.100 100 11.0 0.100 100 14.0 1.200 100 17.0 1.200 100 柱温箱的阀切换 表4.柱温箱阀切换程序 时间/min 阀位置 0.0 1-2 2.0 1-6 4.0 1-2 实验结果 图3空白血样色谱图 图4对照品(5.020 pg/mL)典型色谱图(黑)和空白血样(蓝)色谱叠加图 精密吸取1mL空白血清，分别加入适量万古霉素稀释标准溶，配置成不同浓度的标准溶液，标准品浓度分别为0.502、1.004、2.008、5.020、10.04和20.08 pg/mL，进样体积为200 pL。图5所示为标准曲线，线性回归方程为 Y=0.8161X-0.1251， R2=0.9991，表明在0.502-20.08 pg/mL 浓度范围内线性良好，同时该方法空白血清样品在万古霉素出峰位置(5.41min) 无基质干扰。由于万古霉素-甲醇水(1：1)标准溶液和血清样品溶剂差异较大，建议标准品的加入体积不超过血清样品体积的5%。 图5标准曲线线性回归方程 2.2重现性考察 图6日内精密度重现性考查 取同一样品，按上述色谱条件进样6次，考察目标峰的保留时间及峰面积。结果显示保留时间RSD<0.05%，峰面积 RSD<1.2%，结果表明该方法重复性良好。重复性实验结果如图6，表5所示： 仅用于研究目的。不可用于诊断目的。 No. Sample Name Retention Time， (min) Amount (ug/mL) 1 日内精密度1-1 5.390 10.59 2 日内精密度1-2 5.393 10.70 3 日内精密度1-3 5.393 10.70 4 日内精密度1-4 5.393 10.40 5 日内咪密度1-5 5.393 10.46 6 日内精密度1-6 5.393 10.59 7 Average 5.393 10.58 8 RSD 0.03% 1.16% 2.3加标回收率考查 在相同色谱条件下，取浓度为0.502 ug/mL，5.020pg/mL和20.08 pg/mL 三个浓度点作为低(L)、中(M)、高(H)的三个加标浓度，分别平行处理3个样品，加标血样平均回收率为95.0-115.0%，结果表明回收率准确，方法准确度良好，具体数据表如下所示： 表6血清加标回收率数据统计表 样品名 实际浓度 理论浓度 回收率 平均回收率 (【ug/mL) (ug/mL) 万古霉素-L1 0.565 0.502 112.5% 111.4% 万古霉素-L2 0.567 0.502 113.0% 万古霉素-L3 0.546 0.502 108.8% 万古霉素-M1 4.710 5.020 93.8% 95.3% 万古霉素-M2 4.740 5.020 94.4% 万古霉素-M3 4.910 5.020 97.8% 万古霉素-H1 21.141 20.080 105.3% 104.0% 万古霉素-H2 19.980 20.080 99.5% 万古霉素-H3 21.550 20.080 107.3% 2.4病人实际血样测试 按照上述前处理及分析方法对实际病人A和B的血样进行检测，分别测得血药浓度为7.87 pg/mL和5.53 pg/mL， 见图7和图8，数据结果均在该方法线性范围之内。结果表明该方法满足实际临床的分析和定量需求，对病人的临床的用药具有一定参考意义。 图7实际病人A(来自重庆某医院)血样色谱图 热线8008105118 ( 电话 400 6505118 ) ( www.thermofisher.com ) 图8实际病人B(来自重庆某医院)血样色谱图 本文采用Vanquish Core DGLC自动化样品前处理的Online-SPE方法， 借助HPLC-DAD分析，开发了精准监测血清中抗生素类药物万古霉素的方法。该方法具有灵敏度高、重现性好和耗时短等特点。结果显示，此方法测定万古霉素的线性范围宽，在0.502-20.08 ug/ml范围内保持线性良好，保留时间 RSD<0.1%，峰面积 RSD<1.5%，结果表明该方法重复性好，准确度高，且回收率在90.0%-115.0%，可用于定量分析血清中的万古霉素，系统地为临床个性化、更精准、更合理、更安全地用药提供可靠依据。 ( 1. Hiemke C e t al. Consensus Guidelines f o r Therapeutic DrugMonitoring in Neuropsychopharmacology： U pdate 2 0 17……Pharmacopsychiatry ) ( 2. Murakami S， Hiroi J， Tokuda Y， et al. Methods of estimatingvancomycin use in an inpatient setting： days of therapy versustherapeutic drug m onitoring-based exposure days[J]. Infec-tion Control & Hospital Epidemiology， 2019， 40(3)：375-379. ) ( 3. Aldawsari H M， Hosny K M. Solid lipid n a noparticles of Van-comycin l o aded w i th E l lagic a cid a s a tool f or overcomingnephrotoxic s ide effects： p reparation， c haracterization， andnephrotoxicity evaluation[J]. J ournal of Drug Delivery Scienceand T echnology，2018， 45： 76-80 ) ( 4. Caglayan C ， T a slimi P， D emir Y， et al. 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