乳糖中半乳糖、葡萄糖、蔗糖和果糖检测方案(离子色谱仪)

thermoscientific热线8008105118电话 400 6505118www.thermofisher.com仅用于研究目的。不可用于诊断目的。◎2018 Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。 离子色谱法测定乳糖中有关物质 于凯赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 关键词： 离子色谱； 乳糖； 脉冲安培检测 目标 耗材 建立建立离子色谱脉冲安培检测法测定辅料乳糖中半乳糖、葡萄糖、蔗糖和果糖的方法，对辅料乳糖进行质量控制。 Thermo ScientificTMTarget2TMMNylon Syring Filters (0.45 pm，30mm， P/N F2500-1) 一次性使用无菌注射器，5mL(上海双鸽实业有限公司) 引言 乳糖是由半乳糖通过α-1，4-糖苷键连接葡萄糖而形成的二糖，工业上主要由牛乳清中提取得到。乳糖在制药领域应用广泛，主要用作药物制剂的填充剂、稀释剂和矫味剂，广泛应用于片剂、胶囊剂、颗粒剂和冻干制剂等。相比于淀粉、糊精等其他填充剂，乳糖具有吸湿性低、可压性好、且稳定性和流动性良好等优点。 去离子水， 18.2 MQ-cm (Thermo Scientific GenPure Pro UV-TOC， P/N 50131948) ：氢氧化钠溶液(50%(w/w)水溶液， Alfa Aesar) 半乳糖(分析纯，国药集团化学试剂有限公司) 《中国药典》2015版四部中辅料乳糖项下有关物质采用氨基色谱柱分离，示差检测器进行检测，但氨基柱柱效下降较快、分离度差，且示差检测器具有不能使用梯度洗脱导致分离度差、灵敏度低等缺点。本实验采用高效阴离子交换色谱柱进行分离，脉冲安培检测器进行检测，杂质分离度好，检测灵敏度高。 葡萄糖(分析纯，国药集团化学试剂有限公司) 蔗糖(分析纯，国药集团化学试剂有限公司) 果糖(分析纯，国药集团化学试剂有限公司) 乳糖(分析纯，国药集团化学试剂有限公司) 仪器 Thermo ScientificTM ICS 6000离子色谱系统，包括 -安培检测器 取半乳糖、葡萄糖、蔗糖和果糖各约100 mg，精密称定，分别置100 mL量瓶中，加去离子水适量，振摇使溶解，用去离子水稀释定容至刻度，摇匀，得标准品储备液。 -四元梯度泵 Thermo ScientificTM AS-AP自动进样器 Thermo ScientificTM ChromeleonTM 色谱工作站 精密吸取半乳糖、葡萄糖、蔗糖及果糖标准品储备液适量，加去离子水制成含四种糖浓度为： 0.1ppm、0.2ppm、0.4ppm、0.6ppm、0.8ppm、1.0ppm的系列标准品混合溶液。 样品溶液制备 取样品约400mg，精密称定，置100mL量瓶中，加去离子水溶解并稀释至刻度。将此溶液稀释10倍后，过0.22um滤膜后进样分析。 色谱条件 分析柱： Thermo Scientific CarboPac PA20(150x3 mmP/N：060142) 保护柱： Thermo Scientific CarboPac PA20 (50x3mm P/N：060144) 柱温：20℃ 流速：0.4mL/min 进样量：25uL 检测方式：脉冲安培检测，Au电极(P/N 061875)， Ag/AgCI参比电极(P/N061879)，标准糖四电位。 检测器温度：30℃ 淋洗液：A：水；B： 200mM NaOH 表1淋洗液梯度条件 时间(min) A% B% 0 95 5 25 95 5 25.1 0 100 37 0 100 37.1 95 5 68 95 5 结果与讨论 色谱条件优化 当样品浓度较高时，乳糖主成分峰较大且在半乳糖和葡萄糖保留时间附近有台阶影响杂质的定量；进样乳糖标准品同样存在干扰情况。采用CarboPac PA1、CarboPac PA10及 CarboPacPA20色谱柱均无法避开台阶干扰。发现降低柱温可以减小台阶的影响。采用CarboPac PA1时，氧负峰干扰测定。采用Carbo-Pac PA10时，乳糖前面出现两个台阶，并且第二个台阶对蔗糖测定干扰很大。最终选择CarboPac PA20； 10mM NaOH淋洗液。柱温20℃。另外，也可以进一步降低样品浓度，以降低台阶的影响。 线性范围、检出限及精密度 配制一系列浓度标准溶液(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/L)，在选定色谱条件进进样分析，以色谱峰面积对浓度(mg/L)做标准曲线。结果显示，四种糖在0.1-1.0 mg/L范围 内具有良好线性，相关系数r大于0.999。四种糖的线性范围，相关系数及检出限见表2。 对0.6 mg/L标准溶液重复进样6次，四种糖保留时间及峰面积的相对标准偏差均小于2.0%。 表2四种糖的线性范围、相关系数及检出限 分析物 截距 斜率 范围 相关系数 LOD (mg/L) (r²) (mg/L】 半乳糖 -0.0515 7.5143 0.1-1.0 0.9999 0.01 葡萄糖 -0.1796 8.4834 0.1-1.0 0.9997 0.01 果糖 -0.0069 3.6225 0.1-1.0 0.9997 0.025 蔗糖 -0.0553 3.3001 0.1-1.0 0.9998 0.025 样品测定和加标回收率 在选定的色谱条件下，对乳糖样品进行分析，结果如表3所示。 在样品中加入不同浓度的四种糖标准溶液。四种糖回收率在95-105%之间，说明方法在实际样品测定时具有较高的准确性。结果如表4所示。 表3实际样品测定结果 取样量(mg) 稀释倍数 测得浓度 含量(%) (mL) (mg/L) 样品1 半乳糖 397.3 1000 0.0140 0.0035 葡萄糖 397.3 1000 0.0323 0.0081 果糖 397.3 1000 ND ND 蔗糖 397.3 1000 ND ND 样品2 半乳糖 396.3 1000 0.0170 0.0043 葡萄糖 396.3 1000 0.0326 0.0082 果糖 396.3 1000 ND ND 蔗糖 396.3 1000 ND ND 表4加标回收结果 本底浓度 加入浓度 测得浓度 回收率 平均回收率 (mg/L) (mg/L) (mg/L) (%) (%) 0.2 0.2087 97.4 半乳糖 0.0140 0.4 0.4030 97.3 98.0 0.8 0.8076 99.2 0.2 0.2375 102.6 葡萄糖 0.0323 0.4 0.4290 99.2 101.3 0.8 0.8489 102.1 0.2 0.2073 103.7 果糖 ND 0.4 0.3953 98.8 100.8 0.8 0.7987 99.8 0.2 0.1845 92.3 蔗糖 ND 0.4 0.3844 96.1 95.9 0.8 0.7948 99.4 图1，水空白 图3，样品溶液 图2，标准品溶液(0.2mg/mL) 图4，样品+0.2mg/mL标液 thermoscientific 结论 本实验采用DionexICS6000离子色谱仪，脉冲安培检测法及Carbo Pac PA20色谱柱。可方便地进行乳糖样品中有关物质测定。四种杂质糖与乳糖以及杂质糖之间分离度良好。方法灵敏度高，准确度好，可用于控制辅料乳糖中这些杂质糖的含量。 本实验采用Dionex ICS 6000离子色谱仪，脉冲安培检测法及 Carbo Pac PA20色谱柱。可方便地进行乳糖样品中有关物质测 定。四种杂质糖与乳糖以及杂质糖之间分离度良好。方法灵敏 度高，准确度好，可用于控制辅料乳糖中这些杂质糖的含量。