食品中农药检测方案(液质联用仪)

thermoscientific 监测韭菜中的莠去津七天，未进行仪器维护(QC 为 10 pg/kg) TSQ Quantis 三重四极杆质谱仪性能大提升完美应对食品安全领域目标定量新挑战 作者 Katerina Bousova，1 Michal Godula，Claudia Martins，2 Charles Yang，Ed George，2 Neloni Wijeratne’ 1Thermo Fisher Scientific，欧洲特殊解决方案中心，德赖艾希，德国 2Thermo Fisher Scientific， 圣何塞，加利福尼亚 关键词Pesticide Explorer Collection，欧洲法规 396/2005，委员会指令2006/125/EC， 欧洲委员会2002/657/EC，SANCO/12571/2013，欧洲委员会788/2012/EC，农药，食品，QuEChERS，Vanquish Flex， TSQ Quantis MS，TraceFinder 软件 目的 为快速耐用地定量250余种低于最大残留限(MRL)的农药开发一种全面的 LC-MS/MS分析方法，且该方法的灵敏度、准确度和精密度均符合欧盟指南的严格要求。 前言 农药为农作物上使用的化学品，用于保护农作物免受害虫的破坏。由于农药应用不当可导致严重的健康问题，因此，检测食品和粮食制品中的农药残留成为常规食品控制中的重要组成部分。欧盟(EU)法规(欧洲法规 396/2005 和委员会指令 2006/125/EC)是现行最严格的法规，其规定了植物源和动物源的多种产品中农药的最大残留限。由于一些食品基质要求的定量限(LOQ)较低，因此，这些法规给分析带来了巨大的挑战。 ThermoFisher SCIENTIFIC 本应用文档介绍了综合应用液相色谱仪和三重四极杆质谱仪(LC-MS/MS)解决方案以及 Thermo Scientific TM PesticideExplorer Collection Standard Quantitation 解决方案开发的多残留分析方法，以快速耐用地定量250余种低于最大残留限的农药。该解决方案包括 Thermo Scientific TM QuEChERS 样品制备试剂盒、Thermo Scientific TM Vanquish TM Flex UHPLC 二元系统、Thermo Scientific TM TSQ Quantis TM 三重四极杆质谱仪、Thermo Scientific TM TraceFinder TM 软件、Thermo Scientific TMAccucore TM aQ C18 极性封端 LC 色谱柱以及方法参数，为农药分析提供从始至终的工作流程。该分析方法的结果符合最严格的欧盟指南有关灵敏度、准确度和精密度的要求。 实验 概述 LC-MS/MS分析期间，样品制备的流程概述见图1。进样至LC-MS/MS 系统之前，根据欧洲 EN 15662 QuEChERS 方案对样品进行匀浆和萃取。1，2即用型 QuEChERS 样品制备试剂盒含萃取管和用于样品制备的相关方案。通过特征离子对的选择反应监测(SRM)，基于保留时间和至少两个子离子以及离子比率确认识别农药残留物。 1、称取10g样品，置于50mL 萃取管中。 2、加入 10 mL乙腈(20mL水+10mL乙腈进行润湿)。 3振摇 10 min， 并在5000rpm下离心5 min。 4、将上清液转移至 LC样品瓶中，并将其置于自动进样器中。 图1.工作流程概述 使用基质匹配校正进行定量。根据相关欧盟指南建立所有方法的性能标准。。3-7 分析方法 表1A-1D列出了所使用的试剂、设备、耗材和玻璃容器以及离子源，适当情况下还包括 Thermo Fisher Scientific 部件号。除纯化水外，试剂、设备、仪器、耗材和玻璃容器均来自 ThermoFisher Scientific。农药标准品购于 ULTRA Scientific (美国)。 试剂 部件号 水 UHPLC-MS级 Fisher Chemical TM Optima TM W8-1 甲醇 UHPLC-MS 级 Fisher Chemical Optima A458-1 甲酸铵>99% A115-50 乙腈 UHPLC-MS 级 A956-1 甲酸>99% 28905 表1B.设备/仪器 设备/仪器 Thermo Fisher Scientific部件号或来源 Fisher 精密天平 02225102 Sartorius 分析天平 14557812 Barnstead EASYpure Ⅱ超纯水机 0905043 ULTRA-TURRAXQ S 25N-25 G 分散工具 1713300 ULTRA-TURRAXQ T 25 数显型分散机 3565000 涡旋振荡器 14505141 涡旋通用盖 3205029 Accu-JetQ 移液器 3140246 卧式振动筛 1069-3391 卧式振动筛筛板 1053-0102 离心机， Thermo ScientificM MultifugeX3 Heraeus TM 75004500 TSQ Quantis 三重四极杆质谱仪 TSQ02-10001 Vanquish Flex UHPLC 二元系统 5400.0225 耗材 Thermo Fisher Scientific 部件号或来源 LC样品瓶 32051113 LC 品盖 3151266 移液器， Thermo Scientific TM 3214535 Finnpipette TM 100-1000 pL 移液器， Finnpipette 20-200 pL 3214534 移液器， Finnpipette 10-100 pL 3166472 移液器， Finnpipette 500-5000 pL 3166473 移液器， Finnpipette 1000-10，000 pL 3214536 移液器支架 3651211 移液器吸头0.5-250 uL，500/盒 3270399 移液器吸头 1-5 mL， 75/ 盒 3270420 移液器吸头 100-1000 uL，200/盒 3270410 移液器吸头 20，000-10，000 uL， 40/盒 3270425 移液器，巴斯德钠钙玻璃，150 mm FB50251 移液器抽吸装置 3120891 刮刀，18/10钢 3458179 刮刀，尼龙 3047217 样品架(2mL) 12211001 离心管架 1066-3721 QuEChERS 萃取管，50mL，250包 60105-216 Accucore aQ 色谱柱100×2.1 mm， 17326- 2.6 um 102130 表1D.玻璃器皿 玻璃器皿 Thermo Fisher Scientific 部件号或来源 容量瓶，10mL FB50143 容量瓶， 25 mL FB50147 40mL螺旋盖样品瓶 1054-1593 40mL 螺旋盖样品瓶盖 1009-0962 500mL瓶 9653640 100mL 瓶 1006-8060 烧杯， 100mL FB-102-100 烧杯，200 mL FB-102-200 表 2.LC条件 进样量 1pL 柱温 25℃ 流速 300 pL/min 分析柱 Accucore aQ色谱主 100×2.1 mm， 2.6 pm 运行时间 15分钟 托盘温度 5℃ 喷针清洁溶剂 10%甲醇水溶液 样品定量环 25 pL 流动相 A： 98%的水含2%的甲醇、5mM甲酸铵和0.1% 甲酸 B：98%的甲醇含2%的水、5mM 甲酸铵和0.1% 甲酸 样品的制备 验证实验使用的空白基质样品(韭菜(LK))购自本地零售商店，采用 ULTRA-TURRAX均质器进行匀化，并在制备强化样品之前进行萃取。将基质萃取物用作基质空白样品并用于制备基质匹配校正标准。用于样品制备的即用型 QuEChERS萃取试剂盒含4gMgSO4、1 g NaCl、1g二水柠檬酸三钠和0.5g柠檬酸钠，用于缓冲萃取目标化合物。未使用任意净化步骤。 采用以下步骤进行基质均质化： 1、将相对大量的韭菜基质(~500g)置于大小适合的烧杯中并标记。 2、将25G分散工具附于 ULTRA-TURRAX 均质器上。(注：对于一些不稳定的化合物，为了得到更好的回收率，建议进行低温均质化。8) 3、以中等转速(转速为2-3级)进行均质化以得到平滑的匀浆。 采用以下步骤进行样品萃取： 1、称取 10g样品并置于 50 mL QuEChERS 萃取管中。 2、将 10mL乙腈加入至 LK样品中。 3、将样品置于水平振荡器上振摇 10 min， 并以 5000 rpm 的转速离心5 min。 4、收集上清液并将1mL 上清液转移至 LC 样品瓶中进行仪器分析。 LC-MS/MS分析 采用 Vanquish Flex 二元系统偶联 TSQ Quantis 三重四及杆质谱仪进行LC-MS/MS分析。使用 TraceFinder 软件进行仪器控制、分析、数据查看和报告。LC 条件和梯度见表2和3.优化LC梯度，将分析时间缩短至15分钟，同时维持较好的色谱分离。 表3.LC梯度 时间(min) 流速 (mL/min) %A %B 0 0.300 100 0 0.5 0.300 100 0 7 0.300 30 70 9 0.300 0 100 12 0.300 0 100 12.1 0.300 100 0 15 0.300 100 0 TSQ Quantis 三重四极杆质谱仪以定时 -SRM 模式运行。采用Tune3.0软件中的新化合物优化工具自动优化 SRM 条件。质谱仪设置见表4。 表4.已优化的离子源和 MS 设置 电离模式 加热电喷雾电离(HESI) 扫描类型 timed-SRM 极性 正/负离子切换 正离子模式下的喷雾电压 3700 V 负离子模式下的喷雾电压 2500 V 鞘气压力 30任意单位(Arb) 辅助气压力 6 Arb 吹扫气压力 1 Arb 离子传输管温度 325°C 雾化器温度 350°C 碰撞诱导解离气体压力 2 mTorr 循环时间 0.5s Q1分辨率(FWHM) 0.7 Q3分辨率(FWHM) 0.7 图2显示了含250余种农药的 100 pg/kg 基质加标样品的 LC-MS/MS色谱图(进样量为1uL)。采用定时 -SRM 模式进行分析时，除色谱运行时间短(15分钟)外，还可对农药化合物进行良好分离和检测。在定时-SRM模式下，在已知化合物保留时间周围较窄的保留时间窗口中，对特定目标化合物进行数据采集。定时 -SRM 显著降低了在一定保留时间窗口中平行监测到的 SRM 离子对数量。为了获得可重现且精密的预期定量限，必须在较短驻留时间内具有良好的仪器性能。图3突出显示了在短驻留时间内分析低浓度水平的韭菜时 TSQ Quantis 质谱仪的仪器性能。 相对强度 图2.100 ug/kg 韭菜萃取物中250余种农药的 LC-MS/MS 色谱图。 图3.速度和重现性示例。图A 显示了单位时间内的离子对数。嘧菌酯在 8.69 min 处洗脱，并与其他130个离子对同时采集。图B和C显示了示菌酯的重现性，对比第10次进样和第410次进样。即使在低驻留时间(2.5ms)时，峰面积也保持一致。图C还证实了色谱图复杂区域的峰上含有足够数量的数据点。5 LC-MS/MS工作流程： 卓越的重现性，优异的耐用性 不管样品多么复杂，均希望该分析方法灵敏、可重现且准确。 研究表明，采用 TSQ Quantis MS 定量分析菜菜中农药的灵敏 度优于前面一代三重四极杆质谱仪。 图4总结了 TSQ Endura MS 和 TSQ Quantis MS分析五种农药的对比结果，涉及电离模式和一个较宽的质量数范围。 图4.采用 TSQ Quantis MS(蓝色线条)和 TSQ Endura MS(红色线条)监测五种农药的典型色谱图对比。仪器性能的差异以峰面积和峰高的形式呈现。A)MCPA-负离子电离模式(198.9 105，198.8 141)B)乙肟威-正离子电离模式(163 88. 163 106)C)2，4D-负离子电离模式(218.8 160.9，218.8 125)D)氯化矮壮素-正离子电离模式(122 63，122 58)E)阿巴美丁-正离子电离模式(890.5 305，890.5 307.1，890.5 567.1) 图5.韭菜中的莠去津QC监测，进样次数超过400次， RSD 为 4.5%。红线表示10 p g/kg 浓度下莠去津的响应值±20%。黄线显示将系统置于待机模式下12h的精确时刻(未进行仪器维护)。 图5显示了400余次基质空白进样和10 ppb QC 韭菜样品进样时莠去津的总体响应。将系统置于待机模式下 24h(2×12h)，以证实仪器在待机模式下启动时性能可靠。数据表明，至少进样400次时，响应值在预期值±20%范围内。每次进样之间未进行仪器维护。 结论 欧盟法规规定了食品中农药的最大残留限，但由于必须达到复杂基质中低定量限的要求，因此，该法规给分析带来了挑战。本应用文档介绍了一种多残留 LC-MS/MS分析方法，该方法采用基于 TSQ Quantis 三重四极杆质谱仪的 Pesticide ExplorerCollection Standard Quantitation 解决方案，在小于等于最大残留限水平上快速耐用地定量韭菜中的250余种农药。 该 LC-MS/MS 系统的选择性和灵敏度可用于分析仅1pL 的样品，而不需要进行分散 SPE 样品净化或样品稀释，同时增加了耐用性和通量。 ( 参考文献 ) ( http：//www.thermoscientific.com/content/tfs/en/product/hypersep-dispersive-spe- extraction-products-quechers.html ) ( Anastassiades etal.Fast and easy multiresidue method employing acetonitril e e xtraction/partitioningand "dispersive solid-phase extraction " " for t he d etermination of pesticide r e sidues i n produce.J.Chromatogr.A.2003.1015，163-184. ) Official Journal of the European Communities， COMMISSIONDECISION of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and theinterpretation ofresults.[Online] http：//eur-lex.europa.eu/ legal-content/EN/TXT/PDF/?uri=CELEX：32002D0657&from=EN (accessed April 20，2017). ( Official Journ a l of t he European Uni o n， COMMISSION DIRECTIVE2006/125 / EC of 5 December 2 006 on processed cereal-basedfoods and b a by foo d s for inf a nts and you n gchi l dren.[Online] http：//eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/ PDF/?uri=CELEX：32006L0125&from=EN (a c cessed Ap r il 20，2 0 17) . ) ( E uropean C o mmission Directorate-General fo r Health a n d Food Safety， S afety ofthe F ood C h ain， Pesticides a nd biocides， Guidance documenton a nalytical qualit y control and method validation procedures forpesticides residues analysi s in food andfeed.SANCO/1 1 945/2015.[Online] https：//ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/pesticides_mrl_guidelines _ wrkdoc_1 1 945.pdf (accessed Ap ri l 20 ， 2017). ) ( Official Journal of the European Union， COMMISSION IMPLEMENTINGREGULATION (E U ) No 788/2012 of 31 A u gust 2012 c o ncerning acoordinated multiannual control programme of the Union for 2013，2014 a nd 2015 to ensure compliance with m aximum residue levels ofpesticides and to assess the consumer exposure t o pesticide residuesin and on f o od of plant and animalorigin.[Online]http：//eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/PDF/?uri=CE L EX：32012R0788&from=EN(accessed April 20， 2017). ) ( EuropeanCommission.Plants.EU Pe s ticidesdatabase.[Online] http：//ec.europa.eu/ f ood/plant/pesticides/eu-pesticides-database/ p ublic/?event=homepage&language=EN (a c cessed April 20，2017). ) ( Fussell etal.Food Additives & Contam.2007， 24，1247-1256. ) 图 2 显示了含 250 余种农药的 100 µg/kg 基质加标样品的 LCMS/MS 色谱图（进样量为 1 µL ）。采用定时 -SRM 模式进行 分析时，除色谱运行时间短（15 分钟）外，还可对农药化合物 进行良好分离和检测。在定时 -SRM 模式下，在已知化合物保 留时间周围较窄的保留时间窗口中，对特定目标化合物进行数 据采集。定时 -SRM 显著降低了在一定保留时间窗口中平行监 测到的 SRM 离子对数量。为了获得可重现且精密的预期定量 限，必须在较短驻留时间内具有良好的仪器性能。图 3 突出显 示了在短驻留时间内分析低浓度水平的韭菜时 TSQ Quantis 质 谱仪的仪器性能。