红曲黄酒中乳酸菌对红曲黄酒品质影响的分析检测方案(感官智能分析)

食品研究与开发Food Research And Development2020年2月第41卷第3期生物工程213—— 董蕴，等：乳酸菌对红曲黄酒品质的影响研究生物工程—214 乳酸菌对红曲黄酒品质的影响研究 董蕴i，王强，仇港，杨成聪，罗晶晶，马磊，郭壮，赵慧君1，* (1.湖北文理学院食品科学技术学院鄂西北传统发酵食品研究所，湖北襄阳441053；2.枣阳市食品药品监督管理局，湖北襄阳 441021) 摘 要：该研究通过传统可培养法从米酒样品中分离出9株乳酸菌，在相同的条件下添加9株乳酸菌发酵制备红曲黄酒，并采用酸碱直接滴定法、折光仪法、高效液相-示差折光法和电子舌技术，同时结合统计学的方法对添加不同乳酸菌制备的红曲黄酒的总酸、可溶性固形物、有机酸含量和滋味品质进行评价。结果表明，这9株乳酸菌发酵制备的红曲黄酒总酸、可溶性固形物、有机酸的含量和滋味较未添加乳酸菌制备的红曲黄酒有较大差异，且添加乳酸菌发酵的红曲黄酒的可溶性固形物的含量显著高于对照组，总酸的含量的低于对照组，并经主成分分析可知相同种类的乳酸菌发酵红曲黄酒样品的品质有相似的影响。 关键词：米酒；乳酸菌；红曲黄酒；电子舌；主成分分析 Study on the Effect of Lactic Acid Bacteria on the Quality of Monascus Rice Wine DONG Yun， WANG Qiang'， QIU Gang'， YANG Cheng-congl， LUO Jing-jing， MA Lei， GUO Zhuang， ZHAO Hui-jun (1.Northwest Hubei Research Institute of Traditional Fermented Food， College of Food Science andTechnology， Hubei University of Arts and Science， Xiangyang 441053， Hubei， China； 2. Zaoyang Food and Drug Administration， Xiangyang 441200， Hubei， China) Abstract： In this study， 9 strains of lactic acid bacteria (LAB) were isolated from rice wine samples bytraditional culturable method. Under the same conditions， 9 strains of LAB were added to ferment monascus ricewine samples. Electronic tongue technology， high performance liquid chromatography-differential refractionmethod and statistical methods were used to studied the taste， organic acid， soluble solid and total acid ofmonascus rice wine samples with different LAB. The results showed that the contents of total acid， taste， solublesolids and organic acids of the 9 strains of LAB fermented monascus rice wine were significantly affected and thecontent of soluble solids in the samples added LAB was significantly higher than that in the control group and the ( * 通信作者：赵慧君 ( 1 979 一)，女，副教授，博 士 ， 研 究方向：食品生物技术。 ) ◆1 ( [ 19 ] Shin M S ， P ark S B ， S hin K S. 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Principal component analysis(PCA) showed thatthe same kind of LAB has similar effects on the quality of monascus rice wine. Key words： rice wine；lactic acid bacteria；monascus rice wine；electronic tongue； principal component analysis(PCA) 引文格式： 董蕴，王强，仇港，等.乳酸菌对红曲黄酒品质的影响研究[J].食品研究与开发，2020，41(3)：213-218 DONG Yun， WANG Qiang， QIU Gang， et al. Study on the Effect of Lactic Acid Bacteria on the Quality of Monascus RiceWine[J]. Food Research and Development，2020，41(3)：213-218 红曲，又称红米、红米曲，能够治疗高血压，并且能够调节人体血脂1-2。红曲黄酒是将糯米作为原料，将红曲作为糖化发酵剂酿造而成的，并且黄酒的酒精度比较低，口味清爽适口，富含极高的营养价值，同时黄酒还具有抗氧化抗衰老、降血压降胆固醇和调节机体新陈代谢的功能，因此适当的饮用有利于人体的健康4-5。乳酸菌是指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称6，它是一种存在与人体内的益生菌。而且乳酸菌能够控制人体内毒素水平，保护肝脏并增强肝脏的解毒、排毒功能7-8，具有免疫调节作用，增强人体免疫力和抵抗力19-10，能够使肠道菌群的构成发生有益变化，改善人体胃肠道功能，恢复人体肠道内菌群平衡，形成抗菌生物屏障，维护人体健康1-12)；且具有抗肿瘤、预防癌症的作用. 本试验主要研究乳酸菌对红曲黄酒的总酸、可溶性固形物、有机酸含量和滋味品质的影响。即在红曲黄酒样品中添加不同的乳酸菌，发酵完成后采用酸碱直接滴定法、折光仪法、高效液相一示差折光法和电子舌技术并结合统计学方法，研究红曲黄酒样品的理化性质、有机酸和各滋味指标的变化规律，分析添加乳酸菌对红曲黄酒的整体品质。本研究的目的是研究米酒来源乳酸菌对红曲黄酒的品质影响，探讨其在红曲黄酒中应用的可行性，以其为后续红曲黄酒产品的开发提供新的思路。 1材料与方法 1.1 材料 米酒：湖北米婆婆生物科技有限公司；红曲：丽水力克生物科技有限公司；糯米：襄阳市鑫源超市。 内部溶液、参比溶液、阴离子溶液、阳离子溶液：日本 Insent 公司；乙色(色谱纯)、磷酸二氢钾(分析纯)、磷酸(分析纯)、硫酸铜(分析纯)、亚铁氰化钾(分析纯)、次甲基(分析纯)、葡萄糖(分析纯)、氢氧化钠(分 析纯)、氯化钠(分析纯)、碳酸钙(分析纯)：上海国药集团化学试剂有限公司；MRS培养基、Luria-Bertani 培养基、石蕊牛乳培养基：青岛海博生物技术有限公司；AxyPrep PCR清洁试剂盒：康宁生命科学有限公司；dNTP Mix、2xPCR mix、pMD 18-T载体、rTaq：宝日医生物技术(北京)有限公司(takara 中国)；溶菌酶、蛋白酶K：上海生工生物工程有限公司。 1.2 仪器与设备 LC-20ADXR高效液相色谱仪：日本岛津公司；SA402B电子舌：日本Insent 公司；Abbemat 350 全自动折光仪：奥地利安东帕中国有限公司；vetiri 梯度基因扩增仪：美国AB公司；BX53全功能生物显微镜：美国奥林巴斯公司。 1.3 方法 1.3.1 米酒样品的采集 从湖北省孝感市采集4份米酒样品，装入采样箱中快速的带回实验室进行样品处理。 1.3.2米酒中乳酸菌的分离鉴定 将米酒样品各吸取 1mL上清后加入石蕊牛乳培养基在37℃培养箱中富集24h， 取富集液 0.5 mL 于0.85的生理盐水中进行倍比稀释，取稀释10-5倍和10-6倍的溶液在含有碳酸钙的 MRS 固体培养基上涂布，并在37℃培养箱中培养48 h，挑取有透明圈的单菌落纯化3次后用30的甘油将菌落冻存于-80℃保存备用。 采用十六烷基三甲基溴化铵 (cetrimonium bro-mide，CTAB)法提取菌株的 DNA 后用引物27F和1495R扩增菌株的16S rDNA， 扩增体系为：10x聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)缓冲液 2.5 uL，dNTP (2.5 mmol/L)2 pL，27F 0.5 uL，1495R 0.5 pL，rTaq0.5 pL，DNA 模板 2 uL，ddHo补充至25pL；扩增条件为：94℃，4 min；94 ℃，45 s；55 ℃， 45 s；72℃，1 min30 s；72℃，10 min； 30 个循环。1.0吕琼脂糖凝胶电泳检 测 PCR 产物后清洁试剂盒进行清洁；随后将 PCR清洁产物进行连接、转化和验证，将阳性克隆送往测序公司进行测序。将测序所得结果进行同源性分析后，应用 Mega7.0软件构建系统发育树。 1.3.3 红曲黄酒的制作 糯米经浸米、蒸煮、晾晒后添加 80g 红曲，295 mL浆水和390mL纯净水，同时将在米酒中分离出的9株乳酸菌分别加入酿造罐中，对照组不添加乳酸菌。黄酒放入28℃培养箱中发酵7d后置于18℃中后发酵14d。将发酵好的红曲黄酒从培养箱中取出后，取300g样品于离心机4℃ 3 000 r/min 离心 10 min 取上清备用。 1.3.4 红曲黄酒中可溶性固形物与总酸的影响测定 1)可溶性固形物：将红曲黄酒滴5滴于全自动折光仪的镜面，测定红曲黄酒的可溶性固形物，取3个平行的平均值为最后测量值。 2)总酸：根据国标 GB/T 13662-2018《黄酒》测总酸的步骤，即将10 mL样品置于150 mL烧杯中，并加无二氧化碳的水 50 mL，置于磁力搅拌器上，搅拌时用氢氧化钠标准液滴定，直至 pH8.20为终点。分别记录数据，同时做空白试验。 1.3.5 红曲黄酒滋味品质的测定 按照王玉荣叫的方法，将红曲黄酒用电子舌来测定酸味、咸味、苦味、涩味和鲜味5个基本味及苦味、涩味、鲜味的3个回味。将在阴离子或阳离子中洗涤后的传感器在参比溶液中浸泡30s，得到参比溶液电势V；再置于待测样品中浸泡30s，得到样品溶液电势V，则可通过不同传感器V-V的电势差值评价鲜味、苦味、涩味、咸味和酸味的基本值；洗涤3s后与参比溶液中浸泡 30s，得到电势V'，通过V'-V，的电势差检测苦味、涩味和鲜味的回味。每个样品重复测4次，选后3次的测量数据作为本研究分析的原始数据。 1.3.6 红曲黄酒有机酸的测定 根据郭瑛5的方法测定红曲黄酒中有机酸的含量。其中标准曲线绘制：制取琥珀酸1.5g(加热)、酒石酸 0.75 g、苹果酸 0.3g、乳酸1.5g、草酸 0.15 g，然后用超纯水溶解并定容至50mL，配置成混合标准母液。分别吸取0.1、0.2、0.5、1.0、1.4mL的母液并用超纯水定容至 10 mL 再加200 uL的磷酸混样做标曲，经0.22 pL滤头过滤后使用高效液相色谱法 (high performanceliquid chromatography，HPLC)测定。将红曲黄酒样品各取 2 mL 加200 uL 磷酸定容到10mL，再用0.22uL滤膜过滤后置于 2 mL进样品中使用 HPLC 分析。 测定条件为检测器：紫外吸收检测器；流动相：采 用 0.01 mol/L KHPO(pH2.9)；柱温：30℃；流速：1mL/min；压力：22.0MPa；进样体积：20uL；分离柱型号：C18 Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6x250 mm)5 um；检测波长：214nm。 1.4 统计分析 本研究使用主成分分析 (principal component analysis，PCA)对红曲黄酒滋味品质整体结构的差异进行分析；并使用 SAS9.0软件进行数据分析，使用 Oriqin2017软件绘图，同时使用 Mega7.0 构建系统发育树。 2结果与分析 2.1 米酒曲中乳酸菌的分离鉴定 从4个米酒曲样品中共分离出了9株疑似乳酸菌菌株，所有菌株的过氧化氢试验均为阴性，革兰氏染色均为阳性，且形态均为球状。在菌株分离的基础上 ，本研究对疑似乳酸菌菌株进行了基因组 DNA 提取，并进一步对其 16S rDNA 进行了 PCR 扩增，将 PCR扩增产物于1.0的琼脂糖凝胶电泳进行检测，如图1所示。 2 M表示 DL15000 DNA Marker；1-9分别表示菌株 IMAU50214、菌株IMAU50215、菌株 IMAU50216、菌株IMAU50218、菌株IMAU50381、菌株 IMAU50382、菌株IMAU50387、菌株 IMAU50399、菌株IMAU50400。 图1 乳酸菌16S rDNA的 PCR扩增产物凝胶电泳图 Fig.1 Gel electrophoresis of PCR amplified product of lactic acidbacteria 16S rDNA 由图1可知，9个泳道均在1500 bp 左右的位置出现了一条明亮的条带，同时所有泳道并未出现拖尾现象，因而所有菌株的 16S rDNA 片段 PCR 扩增较为成功，将 PCR 产物进行清洁、连接和建克隆后，送往测序公司进行测序，将反馈后的序列结果进行 Blast分析，得到表1所示结果。 由表1可知，9株乳酸菌菌株与其对应的模式菌株的序列同源性均达在99在以上，菌株 IMAU50214、IMAU50215、IMAU50216和 IMAU50218被鉴定为 表1乳酸菌 16S rDNA列列分析结果 Table 1Results of 16S rDNA sequence analysis of lactic acid bacteria 菌株编号 序列最相似菌株(登录号) 相似度/吕 鉴定结果 IMAU50214 Weissella cibaria LMG17699T(AJ295989) 99 Weissella cibaria IMAU50215 Weissella cibaria LMG 17699T(AJ295989) 99 Weissella cibaria IMAU50216 Weissella cibaria LMG 17699T(AJ295989) 99 Weissella cibaria IMAU50218 Weissella cibaria LMG 17699T(AJ295989) 99 Weissella cibaria IMAU50381 Weissella confusa JCM1093(AB023241) 99 Weissella confusa IMAU50382 Weissella confusa JCM1093(AB023241) 99 Weissella confusa IMAU50387 Pediococcus pentosaceus DSM20336T(AJ305321) 99 Pediococcus pentosaceus IMAU50399 Pediococcus pentosaceus DSM20336T(AJ305321) 99 Pediococcus pentosaceus IMAU50400 Pediococcus pentosaceus DSM20336T(AJ305321) 99 Pediococcus pentosaceus Weissella cibaria(食窦魏斯氏菌)，IMAU50381 和I MAU50382 被鉴定为 Weissella confusa (融合魏斯菌)，IMAU50387、IMAU50399和 IMAU50400被鉴定为戊糖片球菌。同时，将菌株在同源性分析的基础上，使用 Mega7.0构建了系统发育树，结果如图2所示。 图33红曲黄酒总酸和可溶性固形物箱型图 Fig.3 Box diagram of total acid and soluble solids in monascusyellow rice wine 0.1 图2基于米酒中乳酸菌 16S rDNA 序列系统发育树 Fig.2Phylogenetic tree based on lactic acid bacteria 16S rDNAsequence in rice wine 由图3可知，较对照组，添加乳酸菌发酵的红曲黄酒的可溶性固形物和总酸有着显著的差异。添加乳酸菌发酵的红曲黄酒的可溶性固形物的含量显著高于对照组，总酸的含量低于对照组。并且，添加乳酸菌发酵的红曲黄酒的可溶性固形物含量变化幅度不大，而总酸含量变化幅度较大。 由图2可知，菌株IMAU50214、IMAU50215、IMA-U50216和IMAU50218 与 Weissella cibaria LMG17699T(AJ295989)形成了第一个类群，鉴定为食窦魏斯氏菌；菌株IMAU50387、IMAU50400 和IMAU50399 与Pediococcus pentosaceus DSM20336T(AJ305321)形成了第二个类群，鉴定为戊糖片球菌；菌株 IMAU50381和IMAU50382与 WeissellaconfusaJCM1093(AB023241)形成了第三个类群，鉴定为融合魏氏菌。同时结合表 1发现因此该鉴定结果的准确性较高。 2.3 乳酸菌对红曲黄酒有机酸的影响 本研究使用 HPLC对混合标准液进行分析，分析结果如图4所示。 2.2 不同乳酸菌菌制备红曲黄酒总酸与可溶性固形物的分析 红曲黄酒的可溶性固形物主要是黄酒中的糖类物质，根据红曲黄酒所测得可溶性固形物和总酸的指标进行评价，结果如图3所示。 由图4分析可知，较对照组而言，添加乳酸菌W. confuse IMAU50381 和W. confuse IMAU50382 发酵的红曲黄酒中，苹果酸经过“二次发酵”全部转化为乳酸，且菌株 IMAU50381 和 IMAU50382 均为(融合魏氏菌)；)；添加乳酸菌IMAU50387、IMAU50399和I-MAU50400 发酵的红曲黄酒中苹果酸的含量增加，同时添加菌株 IMAU50387和 IMAU50399 发酵的红曲黄酒乙酸降低，且这3株菌均为 Pediococcus pentosaceus(戊糖片球菌)。而添加乳酸菌的 IMAU50215 发酵的红曲黄酒中，琥珀酸的含量显著增加，同时乙酸的含量 图4 红曲黄酒样品有机酸含量堆积柱状图 Fig.4 Histogram of organic acid accumulation in monascus rice wine samples 减少。在添加 IMAU50214 发酵的红曲黄酒中柠檬酸含量减少同时苹果酸含量为零，且样品总体有机酸含量较对照组而言减少。 2.4 乳酸菌对红曲黄酒滋味的影响 本研究进一步对发酵红曲黄酒的各滋味进行相对强度分析，可得到结果如图5所示。 图5 红曲黄酒各滋味指标相对强度箱型图 Fig.5 The relative strength of different flavor indexes of red kojirice wine box 经图5分析可知，与对照相比，添加乳酸菌发酵的红曲黄酒在酸味、苦味、后味 B(苦味的回味)和鲜味4个滋味指标上显著降低；但添加乳酸菌发酵的红曲黄酒在咸味上上升；同时，红曲黄酒对涩味、后味A(涩味的回味)和丰度(鲜味的回味)影响不显著。 2.5 乳酸菌对红曲黄酒品质整体结构的差异性分析 主成分分析(principal component anaiysis，PCA)也称主分量分析，是识别算法中最基本的多元统计方 法，同时能够利用降维的思想，将多指标转变为少数综合指标6.本研究在使用电子舌分析添加乳酸菌发酵的红曲黄酒滋味品质的基础上，使用PCA对红曲黄酒的品质进行了分析。经 PCA 分析发现，信息主要集中在前3个主成分，累计方差贡献率为90.44，其中第一主成分和第二主成分的贡献率分别为31.88和28.44。同时基于主成分分析的添加乳酸菌发酵的红曲黄酒因子载荷图与因子得分图分别如图6和图7所示。 图6 基于红曲黄酒品质主成分分析的因子载荷图 Fig.6 Factor loading diagram based on principal componentanalysis of red koji rice wine quality 由图6可知，第一主成分主要由鲜味、丰度(鲜味的回味)和苦味3个指标构成，第二主成分主要由涩味、咸味和后味A(涩味的回味)3个指标构成。且涩味和苦味分布在第一象限，后味A(涩味的回味)分布在第二象限，咸味分布在第三象限，鲜味和丰度(鲜味的回味)分布在第四象限。 图77基于红曲黄酒品质主成分分析的因子得分图 Fig.7 Factor score diagram based on principal component analysisof monascus rice wine quality 由图7可知，不添加乳酸菌发酵的红曲黄酒即对照组的空间排布整体在第四象限，添加乳酸菌菌株IMAU50381 和 IMAU50382 发酵的红曲黄酒分布在第一象限，因此其涩味和苦味的滋味指标较高，且这两株菌均为 Weissella confuse；添加乳酸菌菌株IMAU50214、IMAU50215 和 IMAU50216发酵的红曲黄酒分布在第四象限，因此其鲜味和丰度(鲜味的回味)的滋味指标较高，且这3株菌均为 Weissellacibaria；添加乳酸菌菌株IMAU50387、IMAU50400 和IMAU50399发酵的红曲黄酒分布在第三和第四象限，因此其咸味的滋味指标较高，且这3株菌均为Pedio-coccus pentosaceus。因此可以发现同种乳酸菌发酵的红曲黄酒呈现出了明显的聚类趋势，且不同种类的乳酸菌发酵的红曲黄酒的各滋味品质各不相同，但是相同种类的乳酸菌发酵红曲黄酒样品的品质有相似的影响。 3结论 本研究从米酒样品中分离出了9株乳酸菌，其中菌株IMAU50214、IMAU50215、IMAU50216和IMAU50218鉴定为 Weissella cibaria；菌株 IMAU50387、IMAU50400和 IMAU50399 鉴定为 Pediococcus pentosaceus；菌株IMAU50381 和 IMAU50382 鉴定为 Weissella confuse.随后用这9株乳酸菌发酵红曲黄酒，并将红曲黄酒进行分析，结果表明：添加乳酸菌发酵的红曲黄酒的可溶性固形物的含量显著高于对照组，总酸的含量低于对照组，并经PCA分析可知相同种类的乳酸菌发酵红曲黄酒的品质有相似的影响。 ( 参考文献： ) ( [1 ] 康珏， 左 矗伟.红曲霉及红曲的功能性研究[J] .农 产品加工， 2 0 1 1 (2) ： 67-69 ) ( [ 2 ] 马美荣，王正祥，诸葛健.红曲有效生理活性物质的研究现状与 进展[J ].酿 酒科技，199 9(5)： 14 -1 5，1 9 ) ( [ 3 ] 梁璋成，何 志 刚， 林 晓姿，等.红曲黄酒酿造工艺与质量控制[J] . 东南园艺 ， 20 14，2(6)：103 - 10 7 ) ( [ 4] 范怀德，乔自林.黄酒营养价值的研究[J ]. 西北民族学院学报(自 然科学版)，20 0 0 ，21(2)：4 7 -4 9 ，61 ) ( [ 5] 倪莉，吕旭聪，黄志清 ， 等.黄酒的生理功效及其生理活性物质 研究进展[J] .中 国食品学报， 201 2 ， 12(3)：1-7 ) ( [6 ] 尹 胜利，杜鉴，徐晨.乳酸菌的研究现状及其应用[J] . 食品科技， 2 012， 3 7(9 ) ： 2 5- 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