食用油、食用脂类中氯丙醇酯、缩水甘油酯检测方案(样品前处理)

GERSTEL Application Note No. 217，2020 基于AOCS Cd 29a-13方法全自动定定食用油脂中的3-MCPD酯和缩水甘油酯 CM Choo1 Maizatul Putri Ahmad Sabri?， Shalene Goh³ 1. LabAlliance Sdn Bhd， 43A， Jalan AB 31/AB， Seksyen 31， Kota Kemuning， Shah Alam，40460，Shah Alam， Selangor， 40460， Malaysia 2. Sime Darby Research Sdn. Bhd 3. Gerstel LLP， 10 Science Park Road， #02-18 The Alpha， Singapore 117684 3-MCPD酯，2-MCPD酯，氯丙醇酯，缩水甘油酯，食用油，实验室自动化， ISO 18363-3， AOCS Cd 29a-13 摘要 氯丙醇和缩水甘油，特别是它们的脂肪酸酯是加工过程中产生的污染物，例如在精炼食用油脂时会形成。 在本应用文献中，描述了一种基于AOCS Cd29a-13 和 ISO 18363-3方法测定食用油中3-单氯丙二醇(3-MCPD)的脂肪酸酯和缩水甘油的脂肪酸酯全自动化解决方案。该方法和这里介绍的解决方案亦可用于测定2-单氯丙二醇(2-MCPD)的脂肪酸酯。 在第一步中，缩水甘油酯与酸化的溴化钠反7形成应形成相应的3-单溴丙二醇(3-MBPD)酯。随后将3-MBPD，2-MCPD和3-MCPD酯进行酸性酯交换反应成其各自的游离形式。衍生化步骤之后，这些化合物的衍生物分别通过GC/MS来测定。全自动方法适用于精炼漂白脱臭的棕榈油样品，以确定这些污染物的浓度水平。结果表明，使用该解决方案所获得的结果与等效的手动参考方法的结果具有良好的相关性。统计t检验表明两者之间没有显着差异。 自动化的样品前处理可简化对油脂中3-MCPD， 2-MCPD和缩水甘油的分析，同时还将实验室人员暴露于潜在有毒溶剂和化学物质的风险降至最低。缩短了总体分析时间，从而提高了样品通量。 介绍 3-单氯丙二醇(3-MCPD)酯，2-单氯丙二醇(2-MCPD)酯缩缩水甘油酯近来特别受到关注，因为在许多类型的食品样品中都发现了这些污染物。通常在存在氯离子的条件下在加工过程中施加高温时会形成此类化合物。例如，在食用油的精炼过程中明显形成大量的MCPD氯丙醇脂肪酸酯和缩宿甘油基基肪酸酯(GE)。图1中概述了该过程的不同阶段。2-和3-MCPD和缩水甘油的脂肪酸酯形成的最关键步骤是最终的脱臭步6吐手骤，该步骤中从油样中去除了不想要的气味和苦味剂。油样摄入后，污染物会在人体中转化为游离形式。 图1：食用油的精炼工艺 3-MCPD已被标记为对人体致癌的可能性较低的物质(2B类)。尽管2-MCPD的作用尚不为人所知，但是如果需要，可以使用此处介绍的方法对其进行监视。而另一方面，缩水甘油已经被分类为对人体致癌的可能性较高的物质(2A类)。 这里展示了一个基于GERSTEL多功能全自动样品前处理平台的样品制备解决方案，它基于AOCSCd 29a-13方法，提供了全自动测定食用油中的3-MCPD酯和缩水甘油酯的方法。 缩水甘油酯在含有溴盐的酸性溶液中转化为3-MBPD单酯。然后，将3-MBPD酯与2-和3-MCPD酯一起在酸性甲醇溶液中转化为游离(非酯化)形式。从样品中萃取在反应过程中形成的脂肪酸甲酯FAME； 然后将2-MCPD和3-MCPD以及3-MBPD用苯基硼酸衍生化以进行GC/MS测定(见图2).o 图2：AOCS方法Cd 29a-13中进行的反应概述。这些可用于测定食用油脂中的2-MCPD和3-MCPD脂肪酸酯和缩水甘油酯(是它们各自脂肪酸酯的总和)。 实验 关键仪器 在GERSTEL多功能全自动样品前处理平台 (MPS robotic， 双头版)上执行自动样品制备。下面列出了此应用文献所使用的关键MPS模块。在液-液萃取步骤中， GERSTEL quickMix快速振动动拌器会剧烈摇晃。如官方AOCS方法中所强调的自动蒸发步骤，可以通过GERSTEL多位置蒸发站(mVAP)来执行。样品前处理平台中包含超声波浴，可在室温下衍生化3-MCPD和3-MBPD。最后样品被注入并转移到分离柱中。使用的GC/MS系统是7890 GC和5977 MSD (安捷伦科技公司)。完整的系统如图3所示。 图3：3-MCPD方法AOCS Cd29a-13样品制备和GC/MS分析系统。 试剂 四氢呋喃，甲醇，正庚烷，丙酮，甲苯，水，硫酸，碳酸氢钠，硫酸钠，苯基硼酸，溴化钠，1，2-双(棕榈酸)-3-氯丙二醇二酯 (PP-3-MCPD)，同位素内标PP-3-MCPD-d5，棕榈酸缩水甘油酯(Gly-P)，同位素内标 Gly-P-d5 样品准备 在10 mL螺旋盖小瓶中称量100 mg油/脂肪，并将其置于MPS上。加入50 uL内标溶液和2 mL四氢呋喃后，将样品转移至GERSTEL quickMix 模块中并剧烈摇动。为了将GE转化为3-MBPD酯，加入30 uL溴化钠酸化水溶液，再次剧烈振摇样品，并在50℃下孵育。最后通过加入3mL的0.6%碳酸氢钠水溶液淬灭反应。为了分离油相和水相，添加2mL正庚烷，然后再次剧烈振摇样品。分离两相后，将上层转移至一个空的10 mL螺旋盖小瓶中，并在mVAP模块中蒸发至干。将残余物重新溶解在1mL的四氢呋喃中。 为了皂化2-MCPD酯、3-MCPD酯和3-MBPD酯，添加了1.8mL的MeOH/H，SO。剧烈振摇样品，并在40℃的恒温Cool Tray中孵育16小时。温育后，通过加入0.5mL饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应。再次孵育并蒸发样品，直到在小瓶中仅剩下1mL混合物为止。加入2mL的硫酸钠溶液和2mL的正庚烷，并且摇动混合物，导致形成两相。丢弃含有脂肪酸甲酯的上层相，并用正庚烷重复萃取。将250 uL苯硼酸溶液添加到最终溶液中，并在室温下于超声浴中孵育5分钟。接下来，通过添加1mL正庚烷，振摇混合物并将上层相转移至空瓶中，提取2-MCPD和3-MCPD以及3-MBPD的苯硼酸衍生物。 萃取液在真空下蒸发，直到小瓶中仅剩下约400uL正庚烷溶剂，然后将其注入GC/MS系统中以测定3-MCPD和缩水甘油的浓度水平。 ·在小瓶中称量100mg样品 添加50uL内标溶液 添加2mL THF* 振荡 quickMIX 添加30uL溴化钠酸化水溶液 振荡 quickMIX 在搅拌器中于50C孵育15分钟** 添加3mL NaHCO，(停止转化反应) 添加2mL正庚烷(从水相中分离出油脂) 振荡 quickMIX 将上层转移到新的样品瓶中 用mVAP蒸发到干燥 将残留物溶于1 mL THF 加入1.8 mL MeOH/H，SO(用于酸催化的酯交换反应)振荡 quickMIIXx 在恒温的Cool Tray中于40C孵育16小时添加0.5mL饱和NaHCO，(终止反应) 振荡 quickMIX 用mVAP蒸发直到~1ml 添加2 mLNa，SO， 添加2mL正庚烷(提取FAME) 摇动quickMIX 去除含有FAME的上层有机相 添加2mL正庚烷(提取FAME) 摇动quickMIX 去除含有FAMES的上部有机层 添加250 uL PBA饱和溶液(衍生化) 在超声波浴中于室温下孵育5分钟 添加1mL正正烷(提取2-和3-MCPD和3-MBPD的PBA衍生物) 振荡 quickMIX 将有机相转移至新的样品瓶中，并在mVAP中蒸发至一400 pL 注入GC/MS 表1： AOCS方法Cd 29a-13的一般制备序列/过程 * 水会干扰缩水甘油酯向MBPD单酯的转化反应；因此建议使用无水四氢氢喃。 必须准确控制反应时间和温度，以避免缩水甘油酯的不完全转化和3-MBPD酯的过分生成。 分析条件 MPS： 1pL 注射量 注射模式： 250℃， 脉冲式不分流注射 色谱柱： 100%聚(二甲基硅氧烷)键合，长度30 mx0.25 mm i.d.×1.0um膜厚 气动： He， 恒定流充： 0.8mL/ min 柱箱： 80℃(1分钟)，10℃/分钟从80℃至170℃，3℃/分钟从 170℃至200℃， 200℃至300℃，15℃/分钟，15分钟至300℃ MSD： T传输线温度：300℃ 离子源温度：230℃ 四极杆温度：150℃ 离子化模式： EI， SIM模式 SIM模式的参数： (i) 3-MCPD的苯硼酸衍生物(m/z) 147(定量离子)；196，198(定性离子)；(ii) 3-MCPD-d5的苯硼酸衍生物(m/z) 150 (3-MCPD的量化离子)：201 (-MCPD的定量离子)：203(定性离子)：(iii) 3-MBPD的苯硼酸衍生物(m/z)147 (定量离子)：240(定性离子)；(iv) 3-MBPD-d5的苯硼酸衍生物(m/z) 150!(定量离子)：245(定性离子)。 结果和讨论 该方法的线性水平是通过分析在8种不同浓度下加标的空白橄榄油样品来评估的。如图3和4所示，对于3-MCPD和Glycidol， 分别获得了出色的线性度， R2值分别为0.9992和0.9999。 图4： 3-MCPD 的校准曲线 0.65 Relative Concentration 图5：缩水甘油的校准曲线 用空白橄榄油样品进行随后的方法参数的验证。分析了八个重复样品，每个样品加有0.07mg/kg的3-MCPD和缩水甘油，并计算了标准偏差(SD)。检测限(LOD) 确定为SD的3倍。LOD分别计算为0.037 mg/kg和0.040 mg/kg(请参见表2)。 3-MCPD (mg/kg) 缩水甘油(mg/kg) 0.07 0.07 1 0.0617 0.0458 2 0.0740 0.0740 3 0.0492 0.0779 4 0.0844 0.0560 5 0.0813 0.0612 6 0.0571 0.0562 7 0.0726 0.0418 8 0.0620 0.0736 平均值 0.068 0.061 Standard Deviation 0.012 0.013 LOD 0.037 0.040 表2：3-MCPD和Glycidol的检测下限 为了确定回收率，将已知量的3-MCPD和缩水甘油加标到空白橄榄油样品中。3-MCPD和缩水甘油的回收率分别为96.0%和87.8%(参见表3)。 加标浓度 3-MCPD (mg/kg) 缩水甘油 (mg/kg) 2.00 2.22 1 111.5 87.8 2 98.0 101.8 3 87.5 77.9 4 97.0 86.5 5 103.5 90.1 6 86.0 88.7 7 88.5 82.0 平均值 96.0 87.8 表3：所得的回收率[%]结果 为了证明自动化方法的良好重复性，将已知量的3-MCPD和缩水甘油加标到精炼的漂白脱臭棕榈油样品中，然后进行自动化样品制备。对于3-MCPD， 计算得出的相对标准偏差(RSD)为9.30%，而对于缩水甘油，则为12.76%。表4显示了基于完整样品制备和GC/MS分析的可重复性。 加标浓度 3-MCPD (mg/kg) 缩水甘油(mg/kg) 0.07 0.28 1 0.0645 0.2160 2 0.0569 0.2490 3 0.0665 0.2610 4 0.0672 0.2520 5 0.0764 0.2160 6 0.0718 0.2080 7 0.0592 0.1820 8 0.0633 0.1940 9 0.0708 0.1990 平均值 0.066 0.220 SD 0.006 0.028 RSD% 9.30% 12.76% 表4：3-MCPD和缩水甘油获得的重复性结果 为了进一步评估自动和手动方法，分析了不同的棕榈油样品(请参见表5)。统计检验(显着性检验)用于评估分析样品的结果；对两个均值样本进行T检验，以识别使用手动和自动方法生成的结果之间是否存在显着差异。观察到，对于3-MCPD和缩水甘油，由于计算的T值小于T临界值，因此未发现显着差异，这表明已成功将手动AOCS CD29A-13方法转移至自动化平台。 3-MCPD (mg/kg) 缩水甘油(mg/kg) 自动化 手动 自动化 手动 棕榈油1 1.71 1.70 0.11 0.12 棕榈油2 0.27 0.30 0.17 0.17 棕榈油3 1.89 1.80 0.20 0.22 表5：实际棕榈油样品分析 结论 在这项工作中，严格遵守方法自动测定3-MCPD和缩水甘油的AOCS Cd29a-13方法，特别是结合了官方方法中所述的自动蒸发和超声处理步骤。蒸发步骤提供了去除过量衍生试剂的额外好处，否则衍生试剂可能会积累在GC/MS系统中并影响系统稳定性。使用统计t检验证明，从自动化系统获得的结果与基于参考手动方法的结果具有很好的相关性，这表明没有显着差异。另外，本方法允许在需要时在单次运行中分析缩水甘油， 3-MCPD和2-MCPD。完整的样品制备和分析工作流程实现了良好的相对标准偏差。 ( 致谢 ) 我们要感谢LabAlliance Sdn Bhd的CM Choo和 Sime Darby Research Sdn. Bhd.的MaizatulPutri Ahmad Sabri 对本AppNote的支持和贡献。 GERSTEL GmbH & Co. KG Eberhard-Gerstel-Platz 1 45473 Mulheim an der RuhrGermany +49 (0)208-765 03-0 +49 (0)208-7 65 03 33 gerstel@gerstel.com www.gerstel.com GERSTEL Brasil Av. Pascoal da Rocha Falcao， 367 04785-000 Sao Paulo -SP Brasil +55(11)5665-8931 +55(11)5666-9084 gerstel-brasil@gerstel.com www.gerstel.com.br -- --  AOCS Cd 29a-13，以下简称a法，是美国石油化学家协会AOCS制定的检测食用油脂中氯丙醇和缩水甘油醇的标准方法之一，属于间接检测法。间接检测法的原理是：把氯丙醇和缩水甘油的脂肪酸酯，通过不同的条件下的酯交换反应（水解）变成游离态的氯丙醇和缩水甘油，然后进行衍生化，使其可以通过气相色谱质谱分析。AOCS Cd 29a、b、c法原理和方法一览AOCS有a、b、c法，相对应ISO18363的3、2、1法，其特点和机制如上图所示。今天我们的应用是使用a法，即在酸性条件下的16小时酯交换反应，来检测食用油脂中的3-MCPD-酯、2-MCPD-酯、缩水甘油酯（GE）。相对其他两种方法而言，方法a的特点是只需运行一次样品，即可以获得三种污染物的浓度大小。氯丙醇酯&缩水甘油酯的危害食用油的精炼过程3-单氯丙二醇（3-MCPD）酯，2-单氯丙二醇（2-MCPD）酯和缩水甘油酯近来特别受到关注，因为在许多类型的食品样品中都发现了这些污染物。通常在存在氯离子的条件下在加工过程中施加高温时会形成此类化合物，例如在食用油的精炼过程中。上图展示了精炼食用油的不同阶段，最后的脱臭步骤是2-和3-MCPD和缩水甘油的脂肪酸酯形成的最关键步骤。被人体摄入后，氯丙醇酯和缩水甘油酯会在人体中100%会转化为游离形式，即转化为3-MCPD、2-MCPD、和缩水甘油。目前3-MCPD被公认为2B类致癌物质，有肾脏毒性、生殖毒性和免疫抑制等危害；缩水甘油是2A类致癌物质，有致癌性和遗传毒性；2-MCPD目前尚未明确。这就是为什么大家越来越关注食品中氯丙醇和缩水甘油的脂肪酸酯的含量的原因。自动化a法ACOC Cd29a-13（ISO18363-3）的自动化解决方案以上就是哲斯泰针对a法的自动化解决方案，该方案成功应用在马来西亚的森那美种植 Sime Darby Plantation，用于棕榈油中氯丙醇酯和缩水甘油酯的检测。AOCS Cd29a-13方法主要步骤在样品中加入内标“d5-3-MCPD棕榈酸双酯”和“d5-缩水甘油棕榈酸酯”。再加入酸性的溴化钠，使缩水甘油酯形成相应的3-单溴丙二醇（3-MBPD）酯。随后将3-MBPD，2-MCPD和3-MCPD酯进行酸性酯交换反应成其各自的游离形式。衍生化步骤之后，这些化合物的衍生物分别通过GC/MS来测定。关键模块之--漩涡振荡所有步骤中的漩涡振荡，都少不了高效的振荡机，哲斯泰的quickMix模块可以在几秒内将水和油混合乳化。关键模块之--真空蒸发标准方法中的氮气浓缩，可以使用哲斯泰的多位蒸发站mVap，不但满足方法要求，并且使用真空蒸发，无需氮气。蒸发步骤大大提高灵敏度，并且去除多余的衍生试剂，保护GCMS。关键模块之--超声波浴方法a需要超声波浴来进行高效的衍生化，哲斯泰的超声波浴模块，完全满足要求。软件集成控制，兼容性高。自动化的结果结果表明，使用该解决方案所获得的结果与等效的手动参考方法的结果具有良好的相关性。统计t检验表明两者之间没有显着差异。自动化的样品前处理可简化对油脂中3-MCPD-酯，2-MCPD-酯和缩水甘油酯的分析，同时还将实验室人员暴露于潜在有毒溶剂和化学物质的风险降至最低。缩短了总体分析时间，从而提高了样品通量。线性度好，3-MCPD和缩水甘油的R2 值分别为0.9992和0.9999检测限（LOD）为0.037 mg/kg和0.040 mg/kg3-MCPD和缩水甘油的回收率分别为96.0％和87.8％标准偏差RSD：3-MCPD为9.30％，缩水甘油为12.76％