水产品中硝基呋喃代谢物检测方案(固相萃取仪)

自动化样品前处理解决方案-RK-2019-F002 Knowledge Optimized Laboratory 解决方案 水产品中硝基呋喃代谢物的测定解决方案 关键词 全自动固相萃取；均质器；浓缩仪；高效液相色谱-串联质谱；硝基呋喃代谢物 介绍 硝基呋喃类药物在人类疾病治疗上也有一定的应用。呋喃妥因(呋喃坦啶)为抑菌剂，多数大肠杆菌、肠球菌对其敏感。呋喃唑酮(痢特灵)口服吸收少，肠内浓度高。主要用于细菌性痢疾和旅游者腹泻。呋喃它酮内服后在肠道不易吸收，故主要用于肠道感染，也可用于球虫病、火鸡黑头病的治疗。呋喃西林临床仅用作消毒防腐药，用于皮肤及粘膜的感染，如化脓性中耳炎、化脓性皮炎、急慢性鼻炎、烧伤、溃疡等。对组织几无刺激，脓、血对其消毒作用无明显影响。 硝基呋喃类因为价格较低且效果好，而广泛应用于畜禽及水产养殖业，以治疗由大肠杆菌或沙门氏菌引起的肠炎、疥疮、赤鳍病、溃疡病等。由于硝基呋喃类药物及其代谢物对人体有致癌、致畸胎副作用，个别国家已经禁止硝基呋喃类药物在畜禽及水产动物食品中使用，并严格执行对水产品中硝基呋喃的残留检测。本文参考国标20752-2006《猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》进行了鱼肉样品中硝基呋喃代谢物的检测。 图1.四种硝基呋喃类代谢物结构图 1.仪器和耗材 Raykol Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站； Raykol Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪； Raykol AH-30全自动均质器； Raykol MPE 高通量真空平行浓缩仪； Raykol AutoEVA-60全自动平行浓缩仪； HLB固相萃取萃 (RayCure HLB， 60mg/3 mL，RC-204-36473)： Agilent 1260高效液相色谱(HPLC)， Agilent6410质谱检测器((MS)； 甲醇(优级纯)，水； 衍生剂：含2-硝基苯甲醛0.05 mol/L，称取0.075g2-硝基苯甲醛溶于10 mL 二甲亚砜，现配现用； 盐酸溶液：0.2 mol/L，量取17 mL 浓盐酸用水定容至1000 mL； 氢氧化钠溶液：：1 mol/L，称取40g氢氧化钠用水溶解，定容至1000 mL。 2.样品制备 2.1标准工作曲线配制 称取5个阴性样品2g(精确到0.01 g)， 分别置于50 mL 棕色离心管中，加入10 mL甲醇一水混合溶液(2+1)，均质1min， 再用5mL甲醇一水混合溶液洗涤均质器刀头，(二者合并4000 r/min离心5 min， 吸取上清液弃掉(该步骤对样品进行清洗，防止目标物对阴性样品干扰)。向5个离心管中分别加入适量四种硝基呋喃代谢物混合标准溶液，使四种硝基呋喃代谢物最终测定浓度分别为0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、4.0 ng/mL、10.0 ng/mL。再向每个离心管中加入适量混合内标标准溶液，使四种硝基呋喃代谢物内标物最终测定浓度均为2.0 ng/mL。 2.2样品提取 向每个样品离心管中加入10 mL 0.2 mol/L盐酸溶液均质1 min， 用10 mL 0.2 mol/L 盐酸溶液洗涤均质器刀头，二者合并后加入0.3mL衍生剂，用液体混匀器混匀，置于37℃恒温振荡水浴中避光反应16h。(由于硝基呋喃代谢物与蛋白质中的氨基酸结合紧密，故需要加入盐酸进行蛋白变性，长时间的恒温水浴利于目标物的析出与衍生化，注意避光保存，硝基呋喃代谢物中的化合物见光易分解。) 2.3固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪 固相萃取柱 HLB (RayCure， 60 mg/3 mL) 活化 甲醇 淋洗 水 洗脱 乙酸乙酯 2.4净化 上述衍生溶液放置至室温后，加入5mL 0.1mol/L 磷酸氢二钾溶液，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节溶液 pH约为7.4，4 000 r/min 离心10 min，上清液(若待测样品含脂肪较多，上清液加5mL正已烧，振荡2 min， 4 000 r/min 离心10 min吸取并弃掉正已烷)。 采用Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪进行固相萃取柱的净化，样液以1mL/min 的流速通过Oasis HLB 柱(根据样品量更改上样体积)，待样液全部通过固相萃取柱后用8 mL 水洗涤固相萃取柱，弃去全部流出液。用氮气吹干 Oasis HLB固相萃取柱5 min (若不进行吹干，下一步的洗脱无法有效地浸润固相萃取柱，导致洗脱效果变差)。用5mL乙酸乙酯洗脱被测物于 15 mL 棕色离心管中，使用 AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪在40℃水浴中吹干，用样品定容溶液(10%乙腈水溶液，含0.3%乙酸)溶解并定容至1.0mL。混匀后过 0.2 Hm滤膜用液相色谱一串联质谱测定。 序号 命令 溶剂 排出 (LTHIn) 1 清洗样品通道 CH30H 80 5 1.5 2 活化 CH30H 废液1 5 6 1.7 3 活化 H20 废液1 5 10 2.6 4 上样 废液1 1 11 11.9 5 清洗样品瓶 H20 废液1 80 2 2.7 6 淋洗 H20 废液1 8 8 1.5 7 气推 废液1 40 5 0.7 8 气推 废液1 160 80 4.8 9 清洗注射泵 CH30H 80 1 0.3 10 清洗注射泵 Eth-Ace Et.. 80 1 0.3 11 洗脱 Eth-Ace(Et... 收集 1 6 6.5 12 气推 收集 20 10 1.3 13 结束 图2. Fotector Plus 硝基呋喃代谢物固相萃取方法 3.检测条件 表1.色谱柱条件 柱子 Waters XBridge BEH HILIC 2.5m×21 mm×150 mm 流速 0.200 mL/min 流动相 A： 0.3%乙酸水溶液，B： 0.3%乙酸乙腈溶液 柱温 35℃ 进样体积 10 uL 检测器 Agilent 6410 离子模式 ESI 吹扫气 11 L/min 氮气温度 350℃ 簇电压 4000 雾化压力 35 psi 梯度洗脱 具体洗脱请见国标 3.1 MRM 参数 表2.4种呋喃代谢物的串联质谱检测参数(具体数值请参考标准) Compound Name Precursor lIon Product Ion Dwell Fragmentor Collision Energy Cell Accelerator Voltage AMOZ 335 291 40 120 18 7 128 40 120 16 7 SEM 209 192 40 115 17 7 166 40 115 12 7 AHD 249 134 40 120 18 7 178 40 120 12 7 AOZ 236 134 40 125 14 7 192 40 125 19 7 3.2色谱图 图为4种硝基呋喃代谢物的衍生物(5 ppb)在液质色谱中的质谱图： x101+ESI MRM Frag=99. 0V CF=0. 000 DF=0.000 CIDe6. 0 (335.0000->291.2000) C05.d 6 5.5 AMOZ 5 4.5 4 3.5 3 2.5 21 1.5 11 0.5 0 -00.5 1.21.41.61.822.22...m366深商163.844.24.44.64.8 4.方法可行性验证 4.1样品基质加标回收实验 为了验证该方法的回收率，本实验向鱼肉样品 (2g)中加入上述4种呋喃代谢物标准品(20uL，100ug/L)，进行加标回收验证。测试结果(如表3)所示。四种硝基呋喃代谢物的回收率在94.5-110.5%之间， RSD 值2.1-5.2%之间。 表3.新鲜鱼肉中的加标回收率及 RSD 值(2pg/kg) 化合物 (Compound) 加标量(ng/g) 平均回收量 平均回收率(%) RSD (%) AMOZ 2.0 1.94 97.0 3.6 AOZ 2.0 2.21 110.5 5.2 SEM 2.0 1.89 94.5 2.1 AHD 2.0 2.05 100.3 2.6 5.结果与讨论 5.1硝基呋喃代谢物容易与蛋白多肽链上的羧基键合，因此需要加入浓盐酸进行蛋白组织破坏及酰基水解。另一，方面，加入硝基苯甲醛进行衍生化，可增大被测物的分子量，进而避免样品基质中小分子杂质对待测物的干扰。 5.2衍生化反应生成的席夫碱处在过酸或过碱的条件下均容易发生分解，因此在避光衍生化16h 后，需要将反应液中和至 pH=7.4左右，然后进行固相萃取净化。 5.3 AMOZ化合物的极性较强，因此需要控制上样速度在1 mL/min 左右，否则 AMOZ衍生物容易穿透固相萃取柱，导致其在液质上的响应值下降。若上样速度大于2 mL/min， AMOZ 的质谱信号将过低：导致其在仪器上无法被检出。 5.4样品(空白，待测样，工作曲线等)衍生化过程中，需要加入合适的内标进行跟踪反应，避 免反应过程中个别样品的衍生化失败，导致测试结果的假阴性。 6.解决方案的优势 睿科 AH-30全自动均质器实现多任务的高通量均质，完全取代了手动均质的过程。一次最多处理32个样品，大大提高工作效率。 Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪采用全自动操作，可以排除人员操作带来的误差，从活化到上样、洗脱一步到位，六通道同时进行；同时Fotector Plus 能够实现高通量处理，最多一天能够处理180个样品，省时省力，真正为批量检测提供帮助。 睿科 Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站能够实现混标制备、标准曲线制备、样品添加和分液等液体样品处理功能，全程无需人员值守，极大减轻工作量并且保护实验人员的身体健康；同时仪 MPE 真空平行浓缩仪/AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪，大大地提高了样品前处理效率，真正完全解放实验室人员劳动。 全自动均质器 全自动液体样品处理工作站 高通量真空平行浓缩仪 全自动固相萃取仪 全自动平行浓缩仪均质 标曲配制 预浓缩 净化 浓缩 RayKol 睿科集团股份有限公司 RayKol Group Corp.， Ltd. 网址： www.raykol.com 电话：400-885-1816 邮箱： info@raykol.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知 @睿科集团股份有限公司 2020年5月版 网址：www.raykol.com邮箱： info@raykol.com热线： 网址：www.raykol.com邮箱： info@raykol.com热线： 硝基呋喃类因为价格较低且效果好，而广泛应用于畜禽及水产养殖业，以治疗由大肠杆菌或沙门氏菌引起的肠炎、疥疮、赤鳍病、溃疡病等。由于硝基呋喃类药物及其代谢物对人体有致癌、致畸胎副作用，个别国家已经禁止硝基呋喃类药物在畜禽及水产动物食品中使用，并严格执行对水产品中硝基呋喃的残留检测。本文参考国标20752-2006《猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》进行了鱼肉样品中硝基呋喃代谢物的检测。