粮食，谷物，白酒，奶制品中真菌霉毒素检测方案(液相色谱仪)

HITACHI 日立Inspire the Next 日立食品中真菌霉毒素检测解决方案 序言 真菌霉毒素是真菌生长过程中产生的次级代谢产物，会污染食品与农作物，危害人和动物的身体健康，对农业生产具有巨大的危害性。常见的真菌霉毒素包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉素、棒曲霉素等。其检测方法包括：薄层色谱法、酶联免疫吸附法、免疫亲和柱净化荧光光度法，高效液相色谱法等。 高效液相色谱法分离效率好，检测灵敏度高是检测真菌霉毒素最常用的方法，可同时检测多种真菌霉毒素，实现对毒素的定性定量分析。本报告参考食品安全国家标准，使用日立高效液相色谱系统，对几种常见的真菌霉毒素进行分析和检测。 目录 1黄曲霉毒素的测定 ...... 224 赭曲霉毒素A的测定 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定. 玉米赤霉烯酮的测定. 5杂色曲霉素的测定..67 棒曲霉毒素的测定 黄曲霉毒素M族的测定. 1.黄曲霉毒素的测定 黄曲霉毒素(AFT)被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质.对人及动物肝脏组织有破坏作用。黄曲霉素常存在于玉米，大豆，调味品，奶制品中，人们食用被黄曲霉毒素污染的食物会造成危害。，其衍生物约有20中，包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 等。，下面参考食品安全国家标准 GB 5009.22-2016第三法第三法高效液相色谱柱后衍生法，使用日立高效液相色谱系统 Chromaster 对食品中黄曲霉素B1、B2、G1、G2进行测定： > 黄曲霉素B1、B2、G1、G2标准样品测定例 对黄曲霉素B1、B2、G1、G2标准样品进行测定，四个组分峰型尖锐，分离良好；保留时间重现性≤0.1%，峰面积重现性≤0.96；四个组分在0.0~30.0ug/L浓度范围内 R2≥0.9995，线性关系良好。 食品样品测定例 <玉米样品> <样品的预处理> 0.07 黄曲霉素 B. 828097 2.80 2.56 109.4 1.0 mL甲醇洗脱，收集滤液，供检测使用 黄曲霉素 B. 505649 2.56 2.56 100.0 <酱油样品> <样品的预处理> (添加30 ug/L 黄曲霉素混合标准溶液800 uL) 酱油 峰面积 计算浓度 样品浓度 回收率% 黄曲霉素 G， 434063 2.20 2.16 101.9 黄曲霉素G， 336470 2.08 2.16 96.3 黄曲霉素 B 610858 2.08 2.16 96.3 黄曲霉素B， 370965 1.88 2.16 87.0 1.0 mL甲醇洗脱，收集滤液，供检测使用 检测的玉米样品与酱油样品，黄曲霉素B1、B2、G1、G2的四种成分得到很好的分离，回收率较好。本实验应用日立 Chromaster-5000 系列，配合荧光检测器，柱后反应单元，分别对黄曲霉素B1、B2、G1、G2成分进行了检测，均得到了良好的结果，充分体现了 Chromaster系列优越的灵敏度以及其卓越的分析能力。 2.赭曲霉毒素A的测定 赭曲霉毒素使一个引起世界广泛关注的霉菌毒素。赭曲霉毒素包括多种结构类似化合物，其中赭曲霉毒素A毒性最大。赭曲霉毒素A是由多种生长在粮食(小麦、玉米、大麦)、花生、豆类等农作物上的曲霉和青霉产生，对动物和人类的毒性主要由肾脏毒、肝毒、致畸、致癌、致突变和免疫抑制作用。本文参考 GB5009.96-2016 第一法免疫亲和层析净化液相色谱法，使用日立高效液相色谱系统 Chromaster 对食品中赭曲霉毒素A进行分析。 > 标准样品测定例 ■分析条件 ■重现性 (8.0pg/L标准溶液， n=6) 标准样品的色谱图(浓度： 8.0pg/L) ■线性 NO. RT(min) Area 1 9.493 37381 2 9.493 37326 3 9.490 37215 4 9.493 37414 5 9.493 37172 6 9.493 37138 AVG 9.493 37274 SD 0.001 115 RSD 0.01% 0.31% 赭曲霉毒素A在2.0~64.0ug/L浓度范围内 R2=0.9996， 线性关系良好；保留时间重现性=0.01%，峰面积重现性=0.31%，重现性良好 > 食品样品测定例 ■样品前处理方法 赭曲霉毒素A标准样品、小米空白样品与添加样品的色谱重叠图 赭曲霉毒素A标准样品、酱油空白样HHB品与添加样品的色谱重叠图 对小米样品和酱油样品进行测定，均未检出赭曲霉毒素A。对小米样品进行加标测试，在 20ug/kg 的添加浓度下，小米中赭曲霉毒素A的加标回收率为82%。对酱油样品进行加标回收率实验，在8pg/kg的添加浓度下，酱油中赭曲霉毒素A的加标回收率为78%。 3.脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(简称DON)， 又名呕吐毒素，是一种单端孢霉烯族毒素，主要由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌产生。人和牲畜摄入了被脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染的谷物，会会起头晕、呕吐、腹泻、发烧等中毒症状。本文参考食品安全国家标准 GB 5009.111-2016第二法免疫亲和层析净化高效液相色谱法，应用日立高效液相系统 Primaide 对食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行分析。 > 标准样品测定例 ■分析条件 脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准样品的色谱图(浓度： 1.0mg/L) ■重现性(1.0mg/L标准溶液， n=6) ■线性 对脱氧雪腐镰刀菌菌醇标准溶液进行了重现性测定，保留时间重现性=0.03%，峰面积重现性=0.43%，重现性良好；线性实验表明，脱氧雪腐镰刀菌烯醇在 0.1~4.0mg/L 的浓度范围内R=0.9999，线性关系良好。 > 食品样品测定例 ■：样品前处理方法 酒类 酱油、醋 免疫亲和净化： 提取：取脱气酒类或不含二氧 提取：取样品25g，置于100 免疫亲和柱：接于注射器下端 化碳的酒类样品20.00g， 置于 mL的容量瓶中，加入5g聚 上样：移取2mL滤液，注入注射器中，调 50mL的容量瓶中，加入1g聚 乙二醇，用纯水定容至刻度， 节压力，使溶液以1滴/s的流速通过↓ 乙二醇，用纯水定容至刻度， 充分摇匀，涡旋混合2 min。 充分摇匀。 淋洗：用5mLPBS清洗缓冲液、5mL纯水 先后淋洗免疫亲和柱，抽干小柱几 过滤： 洗脱：加入1mL甲醇洗脱，收集洗脱液， HPLC测定 定量滤纸过滤后，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液。 ■样品的测定例 保留时间(min) 空白样品与添加样品的色谱重叠图 ■测定结果 样品 成分 添加标准的样品 添加的标液浓度(pg/mL) 添加的量(ug) 添加标准的样品含量(ug) 回收率(%) 白酒 DON 0.8 0.8 0.70 87.50% 白醋 0.8 0.8 0.67 83.75% 酱油 0.4 0.4 0.33 82.50% 对白酒，白醋和酱油中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行了测定，均未检测到脱氧雪腐镰刀菌烯醇。在样品中加入标准样品，进行加标回收率的测定，测定结果见上表。 4.玉米赤霉烯酮的测定 玉米赤霉烯酮又称F-2毒素，是一种白色晶状固体，，它不溶于水，溶于碱性水溶液、乙酸乙酯、乙腈和甲醇等。玉米赤霉烯酮具有雌激素作用，能造成急慢性中毒，F，引起动物(包括人)繁殖机能异常甚至死亡。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、小麦、大米、小米和燕麦等谷物。本文参考食品安全国家标准 GB 5009.209-2016 第一法液相色谱法，应用日立高效液相系统 Chromaster 对食品中玉米赤霉烯酮进行了分析。 > 标准样品测定例 ■标准样品测定例 ■分析条件 玉米赤霉烯酮在 20~640pg/L 的浓度范围内 R2=0.9998，线性关系良好。重现性实验表明，保留时间重现性=0.04%，o，峰面积重现性=0.46%，重现性良好。 > 食品样品测定例 ■样品前处理方法 ■样品的测定例 玉米赤霉烯酮标准样品、小米空白样品与添加样品的色谱重叠图 对小米样品进行测定，未检出玉米赤霉烯酮。对小米样品进行加标回收率实验，在160pg/L 的添加浓度下，小米中玉米赤霉烯酮的加标回收率为72.9%。 5.杂色曲霉素的测定 杂色曲霉素是一种霉菌毒素。本报告参考食品安全国家标准 GB 5009.25-2016第二法液相色谱法，应用日立 Chromaster 系统测定了食品中的杂色曲霉素。样品经免疫亲和柱处理后，通过反相色谱法分离，在紫外检测器325 nm 波长下对样品中的杂色曲霉素进行了检测。 > 标准样品测定例 ■标准样品测定例 分析条件 标准溶液在5.0ug/L~ 100.0 ug/L 浓度范围内有良好线性关系 (r2=0.9999)。对标准样品溶液进行连续进样测定(n=6)， 保留时间重现性=0.06%，峰面积重现性=0.35%，重复性良好。 >食品样品测定例 ■样品前处理方法 ■样品的测定例 对市售的大米、花生、玉米和黄豆等样品进行了测定，在确认未检出杂色曲霉素后，对样品添加了杂色曲霉素的标准品后进行分析，结果确认检出了杂色曲霉素。杂色曲霉素的加标回收率为71.5%~81.7%。结果表明，该方法适用于食品中杂色曲霉素的测定。 6.棒曲霉毒素的测定 棒曲霉毒素又称展青霉毒素、珊瑚青霉毒素，首先在霉烂苹果和苹果汁中发现，广泛存在于各种霉变水果和青贮饲料中，对人体的危害很大，导致神经、呼吸和泌尿等系统的损害，使人神经麻痹、肺水肿、肾功能衰竭，并有致癌作有。本文参考标准 SN/T2008-2007 进出口果汁中棒曲霉毒素的检测方法高效液相色谱法，应用 Primaide 高效液相色谱系统对果汁中棒曲霉毒素进行分析测定。 > 标准样品测定例 ■标准样品测定例 ■分析条件 日立 棒曲霉毒素标准溶液在0.05~1.0mg/L浓度范围内R=1.0000，线性关系良好。对标准样品溶液进行连续进样测定(n=6)，保留时间重现性=0.03%，峰面积重现性=0.38%，重现性结果良好。 食品样品测定例 ■样品前处理方法 ■样品的测定例苹果汁 梨汁 时间(min) 对市售的苹果汁和梨汁样品进行测定，在确认未检出棒曲霉毒素后，对样品添加了棒曲霉毒素标准品后进行分析，结果确认检出了棒曲霉毒素，棒曲霉毒素加标回收率为88.5%~99.9% 7.黄曲霉毒素M族的测定 黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉产生的毒性致癌物，自然界至少存在14种以上不同的黄曲霉毒素。黄曲霉毒素 B1是公认最具毒性的。黄曲霉毒素M1 和黄曲霉毒素 M2 是黄曲霉毒素 B1 和黄曲霉毒素B2的代谢产物。当牛等牲畜食用了被污染的饲料时，经代谢转化成的M 族黄曲霉就会出现在牛奶里。高浓度的黄曲霉毒素可以产生急性肝坏死，，-导致肝硬化或肝癌。慢性接触黄曲霉毒素会增加患肝胆疾病的风险。本文参考 GB 5009.24-2016中的检方法，应用 Primaide系统，对食品中黄曲霉毒素进行了分析。 标准样品测定例 ■分析条件 标准样品的色谱图(浓度： 6.4ugL) ■重现性(6.4 ug/L标准溶液， n=6) NO. aflatoxin M2(6.4ug/L) aflatoxin M1(6.4ug/L) RT(min) Area RT(min) Area 8.307 505888 11.193 221544 2 8.300 506057 11.193 221600 3 8.300 506723 11.193 221857 4 8.307 505794 11.200 220776 5 8.300 507825 11.193 220186 6 8.307 508939 11.200 221147 AVG 8.304 506871 11.195 221185 SD 0.004 1265 0.004 620 RSD 0.05% 0.25% 0.03% 0.28% 黄曲霉毒素M族在0.2~6.4 ug/L的浓度范围内线性关系良好， R²为0.9997。重现性良好。 食品样品测定例 对牛奶、酸奶、奶粉、奶油和奶酪等样品进行测定，均未检出M族黄曲霉毒素。对牛 日立 奶和酸奶样品进行加标回收率实验，在0.2 ug/kg的添加浓度下，样品中黄曲霉毒素M族的加标回收率在 99.37%-101.36%。对奶粉，奶油和奶酪样品进行加标回收率实验，在0.8 ug/kg的添加浓度下，样品中黄曲霉毒素M族的加标回收率在 94.02%-103.29%。 真菌霉毒素是真菌生长过程中产生的次级代谢产物，会污染食品与农作物，危害人和动物的身体健康，对农业生产具有巨大的危害性。常见的真菌霉毒素包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉素、棒曲霉素等。其检测方法包括：薄层色谱法、酶联免疫吸附法、免疫亲和柱净化荧光光度法，高效液相色谱法等。高效液相色谱法分离效率好，检测灵敏度高是检测真菌霉毒素最常用的方法，可同时检测多种真菌霉毒素，实现对毒素的定性定量分析。本报告参考食品安全国家标准，使用日立高效液相色谱系统，对几种常见的真菌霉毒素进行分析和检测。