血浆中胆固醇及相关固醇类物质检测方案(液质联用仪)

用 Agilent InfinityLab Poroshell 120EC-C18 色谱柱和 LC/MS/MS分离血浆中的胆固醇及相关固醇类物质 Rongjie Fu 和 Zhiming Zhang Adam Bivens ( 安捷伦科技有限公司 ) 用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 色谱柱和 LC/MS/MS 分离胆固醇及其代谢物以及多种植物甾醇。通过12种固醇类物质的分离情况对 InfinityLab Poroshell 120的两种固定相EC-C18 和 SB-C18 进行了比较。 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 色谱柱对这些固醇类物质的选择性更好，并且分离度更高。另外还比较了两种不同粒径的InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 填料颗粒。粒径越小，分离度越高，尤其对于紧邻洗脱的异构体，例如7-烯胆甾烷醇和胆固醇。配备 APCI 的 LC/MS/MS 可提供出色的分析灵敏度。 胆固醇及相关化合物(例如胆甾烯醇、β-谷甾醇、链甾醇和7-烯胆甾烷醇)的分析可通过 GC 和 LC 实现。 HPLC 技术在固醇类物质分析领域的应用越来越广泛，并且常与三重四极杆质谱仪联用进行定量分析，以提高灵敏度和选择性。同样，在离子化以及离子传输进入质谱仪方面的技术改进也提高了对生物基质中低浓度代谢物的检测能力。 基于 LC 技术的固醇类物质检测可配合MS、UV 或蒸发光散射检测(ELSD)进行。检测器的选择与分离应用所需的灵敏度相关，其中LC/MS/MS 具有极高的灵敏度。我们利用 Agilent 6460A 三重四极杆LC/MS和大气压化学电离 (APCI) 技术开发出一种正离子模式下的 MS 方法，用于分析表1中的固醇类物质。固醇类化合物的非极性特征使得 APCI成为离子源的最佳选择，因为该技术在正离子模式下无需化合物衍生化即可实现良好的灵敏度。 许多固醇类物质为位置异构体，但由于MS 无法区分同质异位化合物，因此色谱分离对上述物质的分析至关重要。7-烯胆甾烷醇和胆固醇是此类分离中最具挑战性的两个化合物，原因有二：·一是难以实现色谱分离， 二是它们为同质异位化合物。而且在血浆样品中，胆固醇的浓度远高于7-烯胆甾烷醇，进一步增加了分析难度。 本方法采用 InfinityLab Poroshell 120 色谱柱，与全多孔颗粒填料色谱柱相比，其能在更低的反压条件下提供更高的柱效和通量。1.9 pm InfinityLab Poroshell 120 色谱 柱的柱效最高。2.7 um InfinityLab Poroshell120色谱柱的反压低于600 bar， 具有出色的稳定性，并且配备了2 um 筛板，降低了被脏样品(例如血浆)堵塞的风险。 表1.本研究中的分析物 编号 化合物 分子量(g/mol) CAS号 结构 1 25-羟基维生素D3(骨化二醇) 400.64 63283-36-3 HO. HO ~ 2 25-羟基维生素 D2 412.65 21343-40-8 LOH HO 3 链甾醇 384.64 313-04-2 H HO 4 7-脱氢胆固醇(维生素原 D3) 384.64 434-16-2 A HO 5 7-烯胆甾烷醇 386.65 80-99-9 H HO 6 胆固醇 386.65 57-88-5 H H HO 试剂与化学品 所有试剂均为 HPLC级或更高等级。HPLC级乙腈和甲醇购自 J.T. Baker (CenterValley， PA， USA)。水经由 ELGA PURELABChorus 系统 (High Wycombe， UK) 纯化。标准品购自 Sigma-Aldrich (St. Louis， MO，USA)。 仪器与材料 ( 色谱柱入口： Agilent InfinityLab Quick Connect 快速连接液相色谱接头 ( 部 件号5067-5965) ) 色谱柱出口： Agilent InfinityLabQuick Turn 液谱色谱接头(部件号5067-5966) Agilent Captiva 经济型过滤器， PTFE膜，直径13 mm， 孔径0.2 um (部件号5190-5265) 安捷伦样品瓶，螺口盖，棕色，带书写签，经认证，2mL(部件号 5182-0716) 安捷伦固定螺口盖，蓝色，带 PTFE/红色硅胶隔垫(部件号5190-7024) ( Agilent InfinityLab 溶剂 瓶 ，棕色，1000 mL(部件号9301-6526) ) Agilent InfinityLab Stay Safe 溶剂瓶安全盖， GL45，3个插口，1个放空阀((部件号5043-1219) Eppendorf 移液管和重复用移液器超声仪(VWR， Radnor， PA， USA) 仪器 Agilent 1290 Infinity lI高速泵 (G7120A) ( Agilent 1290 Infinity I I multisampler (G7167B) ) ( Agilent 1290 Infinity ll 高容量柱温箱 (G7116B) ) 编号 化合物 分子量(g/mol) CAS号 结构 7 5-胆甾烯-3-酮 384.64 601-54-7 H H O 8 粪甾醇 388.67 360-68-9 H H HO*H 9 胆甾烷醇 388.67 80-97-7 H H H HO 10 菜油甾醇 400.68 474-62-4 H H A HO 11 豆甾醇 412.69 83-48-7 H H AHO* 12 谷甾醇 414.71 64997-52-0 HO* Agilent 6460 三重四极杆液质联用系统(G6460A) ( 软件 ) ( Agilent MassHunter LC/MS 数据采集 软件，版本B.08.00 ) ( Agilent MassHunter 定性分析软件，版本B.07.00 ) HPLC 条件 色谱柱 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18， 3.0×100 mm，2.7 pm (部件号695975-302) Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-C18， 3.0×100 mm， 2.7 pm (部件号685975-302) Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18， 3.0×100 mm， 1.9 pm (部件号695675-302) 流动相A 水 流动相B 甲醇 梯度 0-10分钟：92%-96%B 10-12分钟：96%B 12-16分钟：96%-100%B 停止时间：20分钟 后运行时间：2分钟 流速 0.60 mL/min 柱温 15°C 进样量 20 pL 质谱条件 离子模式 APCI， 正离子 干燥气温度 325°C 气化室温度 350°C 干燥气流速 4L/min 雾化器压力 30 psi 毛细管电压(+) 2000V MRM条件 AEMV， 500 表 2. APCI 采集参数和离子对 化合物 母离子(m/z) 子离子 (m/z) 驻留时间 碎裂电压 碰撞能量 碰撞池 加速器电压 极性 维生素原 D3 367.3 159.2 18 130 13 4 正 维生素原 D3 367.3 145.1 18 130 17 4 正 链甾醇 367.3 95 18 100 22 4 正 链甾醇 367.3 161.1 18 100 17 4 正 胆固醇 369.4 161.2 18 166 10 4 正 胆固醇 369.4 95.2 18 166 38 4 正 7-烯胆甾烷醇 369.4 95.1 18 112 29 4 正 7-烯胆甾烷醇 369.4 81.1 18 112 40 4 正 粪甾醇 371.4 221.2 18 140 21 4 正 粪甾醇 371.4 95.1 18 140 21 4 正 胆甾烷醇 371.4 149 18 150 15 4 正 胆甾烷醇 371.4 95 18 150 30 4 正 骨化二醇 383.3 211.2 18 144 25 4 正 骨化二醇 383.3 107.1 18 144 25 4 正 菜油甾醇 383.4 161.2 18 142 16 4 正 菜油甾醇 383.4 95 18 142 30 4 正 5-胆甾烯-3-酮 385.4 109.1 18 128 40 4 正 5-胆甾烯-3-酮 385.4 97 18 128 21 4 正 25-羟基维生素D2 395.3 377.4 18 166 9 4 正 25-羟基维生素 D2 395.3 269.2 18 166 9 4 正 豆甾醇 395.4 83.1 18 148 17 4 正 豆甾醇 395.4 81.1 18 148 37 4 正 谷甾醇 397.4 161 18 125 18 4 正 谷甾醇 397.4 135.2 18 125 12 4 正 总体而言，使用 LC-MS/MS 在 InfinityLabPoroshell 120 EC-C18 和 SB-C18色谱柱上实现了对12种固醇类物质的分离。分离过程采用由水/甲醇组成的梯度流动相，并在较低的温度(15℃)下进行以提 高分离度。在之前的实验中，使用乙腈流动相可轻松分离关键物质对，但是会严重抑制 APCI 信号。图1的上、中两幅色谱图展示的是 EC-C18与 SB-C18 两种化学键合相之间的选择性差异。对于难分离的同质异位化合物7-烯胆甾烷醇(峰5)和胆固醇(峰6)， InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色谱柱实现了分离，而 InfinityLabPoroshell 120 SB-C18 色谱柱未实现分离。图1底部的色谱图展示的是使用1.9 um InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色谱柱时的分离结果，其对部分异构体(例如7-烯胆甾烷醇与胆固醇)具有出色的分离度。 .链甾醇 7-脱氢胆固醇 (维生素原D3) 7-烯胆甾烷醇 胆固醇 5-胆甾烯-3-酮 粪甾醇 胆甾烷醇 10.菜油甾醇 11.豆甾醇 12.谷甾醇 图 1.使用 InfinityLab Poroshell 120 SB-C18 和 EC-C18 固定相色谱柱分离12种固醇类物质得到的 TIC 色谱图 为提高分析灵敏度，对APCI参数(包括毛细管电压、干燥气流速和雾化器压力)进行了优化。优化后的方法采用 InfinityLabPoroshell 120 EC-C18，3.0×100 mm，1.9 um 色谱柱。图2中12种固醇类物质的 MRM色谱图表明，该方法能够对10 ppb的分析物实现完全分离。 研究发现，毛细管电压对信号至关重要。较高的毛细管电压(例如4000V)会严重抑制APCI 信号，并导致信号不稳定。本应用简报中优化后的毛细管电压为2000V。对 100 ppb标样进行10次进样得到的叠加图(图3)表明本方法具有良好的重现性。 图 2.使用 InfinityLab Poroshell EC-C18， 3.0×100 mm， 1.9 pm 色谱柱分离浓度为 10 ppb 的12种固醇类物质得到的 MRM 色谱图 ×104 图3.使用 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18， 3×100 mm， 1.9 pm 色谱柱，对100 ppb标样进行10次进样得到的叠加图 在实际血浆样品中，胆固醇的浓度远高于其他固醇类物质。血浆样品中胆固醇与7-烯胆甾烷醇的比值接近2000：1，因此要将7-烯胆甾烷醇与高浓度胆固醇分离非常困难。图4展示的是加标12种固醇类物质(10 ppb) 前后的血浆样品的色谱图。 1.01 图 4.使用 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18，3×100 mm， 1.9 pm色谱柱分离空白血浆样品和 10 ppb加标样品得到的 MRM 色谱图 ( 使用6460A三重四极杆 LC/MS 在正离子模式下配合 APCI 检测和 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18， 3.0×100 mm， 1.9 um 色实柱实现了对胆固醇及其部分 代谢物以及其他植物甾醇的最佳分离分 析。该色谱柱实现了关键物质对(胆固醇与7-烯胆甾烷醇)的基线分离，即使二 者的浓度比达到了2000：1。这一点非常 重要，因为这两种化合物具有相同的分子量，只有在达到一定分离度后才能对这两种化合物进行有效的定量分析。 ) 1. McDonald， J. G.； et al. ( A comprehensive method forextraction and quantitative analysis of sterols and secosteroids from human p l asma. J. Lipid Res.2012， 53(7)，1399-1409 ) www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 使用 6460A 三重四极杆 LC/MS 在正离子模式下配合 APCI 检测和 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18, 3.0 × 100 mm,1.9 µm 色谱柱实现了对胆固醇及其部分代谢物以及其他植物甾醇的最佳分离分析。该色谱柱实现了关键物质对（胆固醇与 7-烯胆甾烷醇）的基线分离，即使二者的浓度比达到了 2000:1。这一点非常重要，因为这两种化合物具有相同的分子量，只有在达到一定分离度后才能对这两种化合物进行有效的定量分析。