猪肉猪肝中头孢噻呋及其代谢产物检测方案(液质联用仪)

采用 Captiva EMR-Lipid 结合HPLC-MS/MS测定猪肉猪肝中头孢噻呋及其代谢产物 孙雷 中国兽医药品监察所 ( 公敬欣，邓素文，吴翠玲 ) 头孢噻呋 (Ceftiofur， EFT) 是第三代头孢菌素中的一种，它因抗菌谱广、抑菌活性强、药物半衰期长、药效持久等特点，广泛应用于动物养殖过程中。但是，头孢噻呋在动物饲养过程中的不规范使用会导致药物残留于动物源性食品中，引起一系列食品安全问题；而且可能导致细菌产生耐药性，给人类的健康带来隐患。 EFT进入动物体内后，会在短时间内被吸收，并代谢成同样具有抗菌活性的去呋喃甲酰基头孢噻呋 (Desfuroylceftiofur， DFC)。)o 《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》(GB31650-2019)中指定的头孢噻呋的残留标志物为 DFC， 并且规定牛/猪肌肉组织中的残留限量为 1000 pg/kg， 肝组织中的残留限量为2000 pg/kg. 本文采用 Captiva EMR-Lipid 结合 HPLC-MS/MS 建立了一种分析猪肉和猪肝中头孢噻呋及其代谢产物的方法。该方法采用头孢噻呋代谢产物 DFC 作为标志物，可以更加准确地反映头孢噻呋在动物源性食品中的实际代谢情况，避免仅分析头孢噻呋原型药时无法检出的安全漏洞问题，更好地保障食品安全。 硼酸盐缓冲溶液(pH9)配制：准确称取四硼酸钠1.90 g 和氯化钾0.37 g，加水约90 mL 后用磷酸将 pH 调节至9.0(±0.1)，用水定容至100 mL。 二硫赤藓醇(DTE) 提取溶液的配置：准确称取5.0g二硫赤藓醇，用硼酸盐缓冲溶液 (pH 9)溶解并定容至250mL， 现配现用。 5%甲酸乙腈：水(4：1)溶液的配置：准确量取80 mL乙腈、15 mL水和5mL甲酸，混合均匀。 合并流出液和洗脱液并混合均匀，过Agilent PTFE-Q针头过滤器，上机待分析 图1.样品前处理流程 表1.液相色谱分析条件 色谱系统 Agilent 1290 Infinity ll高液相色谱系统 色谱柱 Agilent·Poroshell 120 EC-C18， 2.1×100 mm，2.7 pm 流动相A 0.05%甲酸水溶液 流动相B 乙腈 流速 0.3mL/min 进样量 2pL 柱温 30°C 梯度条件 0.0 min， 5%B 1.0 min， 5% B 3.0min， 50% B 4.5 min， 50%B 5.0 min， 95% B 6.0 min， 95%B 后运行时间 2 min 质谱 Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统 离子源 ESI+ 监测模式 0 min， MRM，至废液 1 min， MRM， 至MS 干燥气温度 250°℃ 干燥气流速 7L/min 鞘气温度 325°℃ 鞘气流速 11L/min 毛细管电压 3000V 喷嘴电压 300V 表3.头孢噻夫及其代谢产物的质谱参数 化合物 母离子(m/z) 子离子(m/z) 碎裂电压(V) 碰撞能量 (eV) 去呋喃甲酰基头孢噻呋(DFC) 429.8 125.9240.9226.9 130130130 201520 头孢噻噻(EFT) 524.0 241.0210.0 125.9 130130130 162448 头孢噻呋在动物体内主要以其代谢物DFC 的形式存在， DFC 在血浆、尿液和组织中极少以游离状态或原型存在，其通过3位取代基上的巯基与半胱氨酸、谷胱甘肽形成二硫化合物，还可能与血浆蛋白或组织蛋白结合以形成 DFC-蛋白复合物。结合态 DFC 不容易被溶剂萃取出来，因此需要使结合态化合物转化为游离态。DTE(二硫赤藓醇)可以切断二硫酯键，使结合态 DFC 及原型药EFT 转化为游离态 DFC。经过样品前处理后，上机分析的溶液中仅含游离态 DFC。如下表4所示，原型药EFT 转换为游离态 DFC以 EFT平均转换系数表示，并在表5不同加标浓度下的回收率计算时使用。 表4.不同加标浓度下的 EFT 平均转换系数*(n=3) 加标浓度 基质 80pg/kg 100pg /kg 500 pg /kg EFT平均 转换系数 EFT平均 转换系数 EFT平均转换系数 猪肉 1.61 1.41 1.57 猪肝 1.43 1.44 1.32 EFT计算浓度 *EFT平均转换系数= EFT添加浓度 如图3所得数据，以6.25 ng/mL 的基质标准品(用基质空白配置的标准溶液)的峰面积除以6.25 ng/mL 的溶剂标准品的峰面积百分比，考察头孢噻呋代谢产物在不同基质中的基质效应。结果表明，头孢噻呋代谢产物在猪肉、猪肝中的基质效应分别为108%和182%。因此，采用基质校正定量方法。 利用基质空白溶液配制标准溶液，并对其分析绘制标准曲线。该标准曲线在3.125-200 ng/mL 的范围内表现出良好的线性，R²>0.999，如图2所示。头孢噻呋代谢产物在猪肉和猪肝中的平均回收率分别为98.7%-107.0%和89.9%-99.3%，且 RSD 均小于10%(n=3)，如表5所示。以最低添加回收浓度作为方法定量限，计算得到猪肉和猪肝样品的定量限为 80 pg/kg；检测限(S/N≥3)分别为 1.7 pg/kg 和1.9 ug/kg。 表5.不同加标浓度下的回收率*与相对标准偏差(n=3) 加标浓度 80pg/kg 100 pg /kg 500 pg /kg 基质 回收率(%) RSD(%) 回收率(%) RSD(%) 回收率(%) RSD(%) 猪肉 99.9 1.1 107.0 1.9 98.7 3.1 猪肝 99.3 7.4 89.9 7.1 90.3 8.6 (DFC 加标浓度+EFT加标浓度*EFT 平均转换系数) 浓度(ng/mL) 浓度 (ng/mL) 图2.DFC 基质标准曲线 图3.DFC空白样品(黑色)、6.25 ng/mL DFC基质标准品(橙色)、加标样品(同时添加100 pg/kg EFT 和100 pg/kg DFC)(绿色)的 MRM色谱图 结论 本文采用 Captiva EMR-Lipid 结合 HPLC-MS/MS 建立了一种分析猪肉和猪肝中头孢噻呋及其代谢产物的方法。该方法操作简单、回收率高，且以头孢噻呋代谢产物为标志物可以更准确地反映头孢噻呋在动物源性食品中的实际代谢情况，避免仅分析头孢噻呋原型药时无法检出的安全漏洞。 Agilent Captiva EMR-Lipid 过滤柱无需经过活化平衡，就可将乙腈提取液混合一定比例(20%)的水相直接加载到过滤柱上，收集滤液，浓缩或过膜后直接分析，从而大大提高了样品前处理效率。另外， Captiva EMR-Lipid 过滤柱采用特殊的填料结构，可有效去除动物源性食品中的长链脂质化合物，有效避免色谱柱污染，从而大大延长色谱柱使用寿命。总之，本文所述的方法适用于检测猪肉和猪肝中的头孢噻呋及其代谢产物。 消耗品订购信息 消耗品 部件号 Agilent Captiva EMR-Lipid， 300 mg， 3mL 5190-1003 Agilent Poroshell 120 EC-C18，2.1×100mm， 2.7 pm 695775-902 Agilent PTFE-Q 针头过滤器， 0.2 pm， 13 mm 5191-4294 Agilent VacElut 20 固相萃取装置 12234104 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 ( 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ) ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2020 本文采用 Captiva EMR-Lipid 结合 HPLC-MS/MS 建立了一种分析猪肉和猪肝中头孢噻呋及其代谢产物的方法。该方法操作简单、回收率高，且以头孢噻呋代谢产物为标志物可以更准确地反映头孢噻呋在动物源性食品中的实际代谢情况，避免仅分析头孢噻呋原型药时无法检出的安全漏洞。Agilent Captiva EMR-Lipid 过滤柱无需经过活化平衡，就可将乙腈提取液混合一定比例 (20%) 的水相直接加载到过滤柱上，收集滤液，浓缩或过膜后直接分析，从而大大提高了样品前处理效率。另外，Captiva EMR-Lipid 过滤柱采用特殊的填料结构，可有效去除动物源性食品中的长链脂质化合物，有效避免色谱柱污染，从而大大延长色谱柱使用寿命。总之，本文所述的方法适用于检测猪肉和猪肝中的头孢噻呋及其代谢产物。