使用μSPE净化的QuEChERS农产品农残解决方案

(国内某用户 InLab RTC QuEChERS 配置实图) QuEChERS (Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)，是近年来国际上最近发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理技术，由美国农业部 Anastassiades教授等于2003年开发的。 根艮 Steven Lehotayy((Lehotay， S.J. " Revisiting the Advantages of theQuEChERS Approach to Sample Preparation."Sep Science 2013.) 所报道的传统QuEChERS 当前有如下局限性： 太多的修改版本 谷物类植物需要单独的方法 在克菌丹、灭菌丹、敌菌丹还有问题 香料、茶叶和油的基质上还不成熟 复杂基质下的基质干扰 含有脂肪成分的样品回收率低 柱形 SPE 通常比传统的分散性 SPE(d-SPE) 对复杂样品基质提供更好的净化效果。然而，柱形SPE 通常需要更长的样品前处理时间和需要自动化仪器： 在PAL3使用 uSPE 净化柱子，使自动化的柱形 SPE 成为现实 在柱子的小型化柱形(uSPE) 生产工艺 (Micro SPE) 在每个样品上显著的减少了溶剂的使用和缩短了前处理的时间。 在 PAL3上，无论是液质还是气质，我们都可以实现样品前处理和色谱质谱运行的样品叠加前处理，这样大大的节省了样品前处理所需要的时间，因而提高了实验室的样品通量。 uSPE 采用可丢弃的净化小柱 标准QuEChERS 流程：一系列的手动样品前处理! 使用 uSPE 净化的 QuEChERS 流程：完全的自动化净化工作流程 自动化净化工作流程： 自动化 uSPE 样品净化： PAL3 uSPE QuEChERS 净化流程配置 在一项研究中， PAL3 uSPE QuEChERS 同时测定200种农药和65种环境污染物， 其中约210种回收率在70-120%之间，且重现性≤20%。(Journal ofChromatographyA，1572 (2018)203-211) (国内某用户 InLab RTC QuEChERS 配置实图) Lehotay 实验室关于p/SPE 的 GCMSMS 验证 uSPE 净化工作流程： Step Description Time (s) 1 Wash the 1 mL syringe with MeCN (2 pumps of 0.5 mL each) 30 2 Load 300 pL extract from AS vial in Trayl into 1 mL syringe 10 3 Place mini-cartridge above collection AS vial (with glass insert) in Tray2 10 4 Elute extract through mini-cartridge at 2pL s 150 5 Discard mini-cartridge into waste receptacle 5 6 Wash the 1 mL syringe with 1/1/1 MeCN/MeOH/water (2 pumps of 0.5 mL each) 30 7 Wash the 1 mL syringe with MeCN (4 pumps of 0.5 mL each) 45 8 Switch to 100 pL syringe and wash with MeCN (2 pumps of 50 pL each) 50 9 Add 25 uL MeCN to collection AS vial (with glass insert) in Tray2 10 10 Add 25 pL AP + QC soln to collection AS vial (with glass insert) in Tray2 10 11 Wash the 100 pL syringe with 1/1/1MeCN/MeOH/water (5 pumps of 50 pL each) 50 12 Wash the 100 pL syringe with MeCN (3 pumps of 50 pL each) 40 13 Switch to 1 mL syringe and move to home position 40 The cleanup itself only took ≈3 min， and syringe wash and exchange steps took ≈5 min 保护剂含有：2.5毫克每毫升古洛糖酸内酯和d-山梨糖醇，1.5毫克每毫升莽草酸，25毫克每毫升乙基甘小州达 “进样口衬管经过带有基质的230次进样后，进样口仍然比较干净" c广州智达 自动化净化工作流程-LCMSMS应用 Hill Labs >3年的经验，>900种基质，>1000样品量每周 农残分析中，自动化的用 uSPE 对样品 QuEChERS 净化提取 ·牛油果被选择用作具有代表性的高脂肪含量的样本 ·初次提取液根据欧盟(CEN) QuEChERS方法，柠檬酸缓冲液，1：2比例的水果加入到乙中(5克水果，10毫升乙腈). 使用 uSPE 净化的 QuEChERS 流程 uSPE 净化工作流程 1.用洗脱溶剂清洗针 2.用200uL 洗脱液 Condition uSPE 小柱 @ 2uL/sec 3.移动 uSPE 小柱到洗脱盘 4.上100 uL QuEChERS 提取液到 uSPE 小柱 @ 2uL/sec 5.用洗脱溶剂清洗针 6.用100微升洗脱液洗脱 u SPE小柱 @ 2uL/sec 7.丢弃用好的p SPE小柱 8.用缓冲溶液稀释两相洗脱液用于LC-MS/MS分析 9.加入被分析物保护剂 10.进样到GCMS 或 LCMS 提取液净化的有效性 在用缓冲溶液稀释后(10mM甲酸铵/甲酸，pH=4)，初始的牛油果提取液可见是浑浊的，使用uSPE 净化以后，浑浊度明显改善。 牛油果初次提取液和经过uSPE净化以后的样品在LC- MS色谱图上的比较。 广州智达 Percent recoveries versus percent standard deviations for 100 pg/kg spikes of 274 pesticide analytes on avocado， extractedbyCEN QuEChERS， cleaned up by uSPE and analyzed by LC-MS/MS. Calibrated against solvent-only staaard一州智达normalized to triphenylphosphate，N= 10 ·QuEChERS-uSPE净化方法是基于有效去除牛油果提取液中的油基质所开发出来的，用缓冲液进行稀释后得到清液，比较传统的MgSO4/PSA/C-18 dSPE 净化。 ·在 QuEChERS 中油样品中三酸甘油脂的去除一直比较困扰，它的去除对LC-MS/MS分析来说是非常重要的， 因为它可能残留在 HPLC 系统中，或导致非极性的农残化合物的丢失。 ·结合使用 PAL3 自动进样器以及优化的洗脱液，得到274种农残化合物的可接受的回收率，并且得到低的相对标准偏差和最少的在 LC-MS/MS的基质抑制效应。 ·uSPE 净化方法已经被验证为可靠的稳定的方法，甚至能满足商业实验室大通量的实验室需求。 Morris Shriner 2014- Eliminating the need for Matrix-matched Calibration Standards_QuEChERS CleanupPoster Morris Shriner 2015- Automated Column SPE Cleanup ofQuEChERS Extracts Using a Zirconia-Based Sorbent forPesticide Residue Analyses by LC-MS/MS Hayward 2016-ITSP Automated Chromatographic SPEusing the PAL Autosampler， American LaboratoryHuebschmann Boehm-Poster EPRW 2016， Limassol，CyprusHuebschmann Boehm - Poster ISCC 2016， Riva del Garda，Italv Lehotay Han 2016-Automated Mini-Column SPE Cleanupfor High-Throughput Analysis of Chemical Contaminants inFoods by GC-MS/MS， Chromatographia， DOI10.1007/s10337-016-3116-y. 摘要  GB23200.121-2021 食品安全国家标准《植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定液相色谱—质谱联用法》已经生效，标准采用QuEChERS前处理方法、液相色谱-三重四极杆串联质谱一次进样正负源切换同时测定331种农药及44种农药代谢物，解决了现行液质标准适用农产品基质种类少、农药及代谢物品种不全、前处理操作复杂、部分农药方法定量限高于最大残留限量等诸多问题。微型固相萃取（μSPE）技术，将几十毫克的各种固相萃取填料压缩进一个体积很小的柱中。与QuEChERS相比，μSPE不仅具备净化性能，同时大大减少了实验过程中有机溶剂的损耗，还可实现自动化，具有广阔的应用空间。因此，本研究分别采用4种典型基质，上海青（深色蔬菜）、洋葱（紫色，深色蔬菜）、杏鲍菇（食用菌）、红茶（茶叶），评价了μSPE处理下191种农药的加标回收率。本方法参考国家标准GB 23200.121-2021 食品安全国家标准植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定液相色谱—质谱联用法，进行了优化。利用全自动前处理平台（广州智达，PAL RTC）进行全自动的μSPE进行了样品净化处理，再利用超高效三重四级杆液相色谱-质谱联用仪进行了191种农药的多残留分析。1.试样制备蔬菜和水果的取样量按照相关标准的规定执行，食用菌样品随机取样1kg。样品取样部位按照GB2763的规定执行。对于个体较小的样品，取样后全部处理；对于个体较大的基本均匀样品，可在对称轴或对称面上分割或切成小块后处理；对于细长、扁平或组分含量在各部分有差异的样品，可在不同部位切取小片或截成小段后处理；取后的样品将其切碎，充分混匀，用四分法取样或直接放入组织捣碎机中捣碎成匀浆，放人聚乙烯瓶中。取谷类样品500g，粉碎后使其全部可通过425μm的标准网筛，放人聚乙烯瓶或袋中。取油料作物、茶叶、坚果和香辛料各500g，粉碎后充分混匀，放入聚乙烯瓶或袋中。植物油类搅拌均匀，放入聚乙烯瓶中。将试样按照测试和备用分别存放。于-18℃条件下保存。2.μSPE样品预处理2.1蔬菜与食用菌 称取10g试样（精确至0.01g）于50mL塑料离心管中，加入10mL乙腈、4g硫酸镁、1g氯化钠、1g柠檬酸钠、0.5g柠檬酸氢二钠及1颗陶瓷均质子，盖上离心管盖，剧烈震荡1min后4200r/min离心5min。2.2茶叶和香辛料  称取2.00g试样（精确至0.01g）于50mL塑料离心管中，加10mL水涡旋混匀，静置30min。加入15mL乙腈-醋酸溶液、6g无水硫酸镁、1.5g醋酸钠及1颗陶瓷均质子，盖上离心管盖，剧烈振荡1min后4200r/min离心5min。以上样品预处理后均经过μSPE处理收集滤液后进样分析。3.高效液相色谱-串联质谱法色谱条件 色谱柱：WATERS AQUITY BEH C18 (100  × 2.1 mm，2.6 μm )流动相：A：0.1%甲酸水溶液    B：乙腈-0.1%甲酸水溶液流速: 0.3 mL/min柱温: 50 ℃进样量: 2 µL梯度：时间（min）流速（mL/min）流动相A（%）流动相B（%）00.397310.39731.50.385152.50.35050160.3298190.329819.10.3973220.3973质谱条件 离子源: 电喷雾离子源（Electrospray ionization，ESI）正离子扫描监测方式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）离子源接口电压：5500V气帘气：氮气35psi加热气：干燥空气60psi源温：550℃利用Scheduled MRM法一针进样对GB23200.121-2021中191种农药进行分析，农药列表见表1。图1为191种农药的质量色谱图，由图中可知，目标农药组分主要在3min-15min间出峰。各农药的质量色谱图见附件1。分别向空白基质中添加多农残标准品，使上海青、杏鲍菇、洋葱基质中各农药添加水平为0.01mg/kg，使茶叶基质中各农药的添加水平为0.05mg/kg。图2-图5为不同基质加标样品的总离子流图，图中各平行样品的总离子流图分别用蓝、粉、红、绿四种颜色显示。各平行样本见总离子流图轮廓一致，未见偏移，表明μSPE处理下农药多残留分析结果稳定。各农药的加标回收率如表1所示。在μSPE处理下，141种农药加标回收率在4种基质中均在80%-120%之间；14种农药加标回收率在3种基质中介于80%-120%之间，包括保棉磷、苯线磷、氟菌唑、环丙唑醇、甲基二磺隆、甲基噻吩磺隆、喹螨醚、氯吡嘧磺隆、醚苯磺隆、噻虫嗪、杀线威肟、酰嘧磺隆、乙拌磷亚砜、乙氧磺隆；13种农药加标回收率在2种基质中介于80%-120%之间，包括胺鲜酯、百治磷、丁苯吗啉、呋虫胺、咯菌腈、甲基硫环磷、甲基硫菌灵、生物苄呋菊酯、霜脲氰、脱甲基-抗蚜威、萎锈灵、乙拌磷、乙氧氟草醚；5种农药加标回收率仅在种基质中介于80%-120%之间，包括苯锈啶、氯草敏、嘧菌环胺、噻苯隆、亚砜磷。表14种基质中191种农药的加标回收率（n=4）以上数据来源于江南大学4. PAL3 µSPE QuEChERS净化流程配置5.结论实验结果表明，μSPE可有效应用于农药多残留分析中，满足多农残分析中回收率及稳定性的要求。依托智达PALRTC全自动前处理平台的自动μSPE前处理流程，可实现无人值守的样品高通量制备和进样分析，显著提高了实验效率，降低了实验中引入认为误差的可能性，同时显著降低了实验室人力成本，展现了很强的应用优势。END