动物源性食品中氯霉素类药物残留检测方案(液质联用仪)

动物源性食品中氯霉素类药物残留LC-MS/MS分析方法 背景 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素同属酰胺 醇类抗生素，具有广谱抗菌能力。氯霉素 曾在畜牧业中广泛用于动物各种传染性疾病的治疗。但氯霉素有严重的副作用和毒性作用，，它能抑制人体骨髓造血功能，引起人体再生障碍性贫血等副作用。因此，为保障动物源性食品安全，确保此类药物不对人类的健康造成危害，世界各国都对其作出严格规定，严禁氯霉素在食用动物上使用。世界上许多国家禁止此药用于食品动物，并规定了在畜产品中氯霉素不得检出。 我国农业部235号公告中将氯霉素列为禁用药物，规定了甲砜霉素的最高残留量为50 ug/kg， 氟甲砜霉素的最高残留量为1000 ug/kg。。2002年1月，美国食品与药品管理局(FDA)公布了禁止在进口动物源性食品中使用11种药物，氯霉素列为首位。 样品前处理方法 适用于动物源性食品中氯霉素类药物的测定。 提取方法 动物组织(肝、肾除外)与水产品： 称取试样5g(精确至0.01g)， 置于50 mL具塞离心管中，加入100 uL氯霉素气代内标(氯霉素-D5)工作溶液和30mL乙腈，匀浆，离心5 min。将上清液移入250 mL分液漏斗中，加15 mL乙腈饱和的正己烷，震荡5 min， 静置分层，转移乙腈至100mL棕色心形瓶中。残渣中再加入30mL乙腈，振摇3min， 离心5 min， 取上清液转移至同一分液漏斗，振荡5 min， 静置分层，转移乙腈层至同一棕色心形瓶中。向心形瓶中加入5mL正丙醇，于40℃水浴中旋蒸至近干，氮气吹干，加5mL丙酮-正己烷(1：9)溶解残渣。 动物肝、肾组织： 称取试样5g(精确至0.01 g)， 置于50mL具塞离心管中，加入30 mL乙酸钠缓冲液，均质2min，加入300 uLβ-葡萄糖醛酸苷酶，于37℃温育过夜。消解样品中加入100uL氯霉素素代内标(氯霉素-D5)工作溶液，20 mL乙酸乙酯-乙醚(75：25)，振摇2min， 离心5 min。将上层有机层移入心形瓶中，于40℃水浴中旋蒸至近干，氮气吹干，加5mL丙酮-正己烷((1：9)溶解残渣。 蜂蜜： 称取蜂蜜试样5g(精确至0.01 g)， 置于50 mL具塞离心管中，加入100 uL氯霉素气代内标(氯霉素-D5)工作溶液，5mL水，再加入20mL乙酸乙酯，振摇2 min， 离心5 min。将上层有机层移入100 mL 棕色心形瓶中，于离心管中再加入20 mL乙酸乙酯，振摇2 min， 离心5 min， 合并有机层于棕色心形瓶中，于40℃水浴中旋蒸至干，3mL水溶解残渣，混匀。 净化方法 动物组织与水产品 用5mL丙酮-正己烷(1：9)淋洗LC-Si 硅胶小柱，弃去淋洗液，将残渣溶解溶液转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，用5mL丙酮-正己烷(6：4)洗脱，收集洗脱液于心形瓶中，40℃水浴中旋转蒸发近干，用氮气吹干，加1mL水定容，定容液过0.45 um滤膜至进样瓶，待测定。 蜂蜜 分别用5mL甲醇，5mL水活化 EN 固相萃取住，将提取液转移上柱，用5mL水淋洗，用玻璃棒压干1min， 用3 mL乙酸乙酯洗脱，洗脱液用氮气吹干，用1mL水定容，定容液过0.45 um滤膜至进样瓶，待测定。 LC-MS/MS 方法 液相色谱参数： 色谱柱： Brownlee SPP C18， 100 mm*2.1 mm， 2.7um(货号：N9308404) 柱温：35℃ 流动相： A：乙腈，B：超纯水 流速：0.4mL/min 运行时间：5min 梯度洗脱：洗脱程序见表1： 表1.液相梯度洗脱条件 时间(min) A/% B/% 0.00 10 90 0.50 10 90 1.00 90 10 2.00 90 10 2.01 10 90 5.00 10 90 质谱参数： 表2.氯霉素类化合物质谱参数 序号 化合物 英文名称 CAS No. 保留时间/min MRM 离子 EV/对 CCE/ V eV 1 氯霉素 Chloramphenicol(CAP) 56-75-7 2.00 320.5/151.6 --20 27 320.5/256.8 -20 17 2 甲砜霉素 Aminomethyl(TAP) 15318-45-3 1.89 353.5/184.6 -19 30 353.5/289.9 -19 18 3 氟甲砜霉素 Florfenicol(FF) 73231-34-2 1.99 355.7/184.5 -19 27 355.7/335.6 -19 14 离子源参数： 离子源模式：电喷雾离子源，负离子模式 (ESI-) 反吹气：：150 雾化气：220 离子源温度：500℃ 离子源喷雾电压：-4500V 氯霉素类化合物的标准曲线线性和相关系数R²见表3.氯霉素和氟甲砜霉素的标准曲线的浓度梯度依次为：0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 ng/mL。甲砜霉素的浓度梯度为0.05-20 ng/mL。猪肉基质样品添加回收实验回收率和重复性数据见表4。 表3.氯霉素类化合物的标准曲线线性 化合物 线性范围(ng/mL) 线性方程 相关系数R 氯霉素 0.02-20 v=39.18x+167.18 0.9998 甲砜霉素 0.05-20 y=10.51x-37.35 0.9996 氟甲砜霉素 0.02-20 y=32.57x+323.44 0.9998 表4.猪肉基质添加回收实验回收率及重复性数据(n=6) 添加回收浓度 添加回收浓度 化合物 (0.05 ng/mL) (0.1 ng/mL) 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% 氯霉素 94.38 3.59 98.83 2.37 甲砜霉素 96.19 4.65 102.88 3.57 氟甲砜霉素 99.14 2.68 103.85 3.82 从表3可以看到，氯霉素类化合物的标准曲线在0.05-20ng/mL范围内具有良好的线性 (R>0.99)其中，氯霉素和氟甲砜霉素的线性范围为0.02-20 ng/mL；表4猪肉基质加标回收率在94.38%-103.85%之间，重现性在2.37%-4.65%之间，完全符合残留检测要求。本方法完全满足氯霉素药物残留的检测要求，适用于氯霉素类药物残留的日常检测。 结论 PerkinElmer QSight 210M系列液相串联三重四级杆质谱仪，可以完全满足动物源性食品中氯霉素类药物的日常检测工作。该系统离子源具有自清洁功能以及质谱接口 HSID 热源去溶剂技术，提高仪器抗污染能力，从容应对复杂基质的食品安全检测。 ( 参考文献 ) 1. GB/T 22338-2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定 PerkinElmer SPP系列色谱柱订购信息：色谱柱采购直线：021-60645658，021-60645659 电子邮件： consumable.china@perkinelmer.com 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司 地址：上海每江高科技园区张衡路1670号 邮编：201203 电话：021-60645888 传真：021-60645999 www.perkinelmer.com.cn PerkinElmer QSight 210TM 系列液相串联三重四级杆质谱仪，可以完全满足动物源性食品中氯霉素类药物的日常检测工作。该系统离子源具有自清洁功能以及质谱接口HSID 热源去溶剂技术，提高仪器抗污染能力，从容应对复杂基质的食品安全检测。