生物治疗药物中非特异性结合问题检测方案(其它通用分析)

「技术简报WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「技术简报] 使用具有MaxPeak高性能表面且兼容LC-MS分析的QuanRecovery样品板解决生物治疗药物的非特异性结合问题 Caitlin Dunning， Mary Lame， Mark Wrona， and Kim Haynes 研究目的 证明采用MaxPeak" HPS (High PerformanceSurfaces， 高性能表面)技术的QuanRecovery"样品板能够显著减少单克隆抗体药物的非特异性结合，从而提升分析方法性能。 背景 为了以更安全的剂量水平实现更好的疗效，新开发的生物治疗药物变得越来越复杂1。为支持这类药物的开发，需要使用灵敏度和选择性更高的分析方法，达到更低的检测限。而样品接触到样品板、样品瓶或移液枪头等实验室器皿时发生的非特异性结合(NSB)或吸附，是单克隆抗体(mAb)等疏水性生物大分子的分析中经常出现的问题2。这种现象与分子的理化性质有关，通常在低浓度下更为明显。样品的非特异性吸附可能导致回收率降低、分析物损失、分析方法重现性差，最终导致分析达不到所需的检测限。因此，尽可能减少非特异性结合非常重要。 疏水性生物大分子容易发生非特异性结合(non-specificbinding，NSB)。使用可减少非特异性结合的实验室器皿能够显著提升分析性能。 图1.标准聚丙烯样品板以及采用MaxPeak HPS技术且兼容LC-MS分析的QuanRecovery样品板对完整单克隆抗体的回收率。用纯溶液制备阿达木单抗、西妥昔单抗和NISTmAb(100ng/mL)样品并在受试样品板中温育。制备含有载体蛋白的样品溶液作为回收率100%的基准样品。 应对NSB问题的常用方法是向样品中加入载体蛋白。载体蛋白会覆盖样品接触的表面，从而减少表面对目标分子的吸附。虽然该策略通常有效，但会增加样品的复杂性。为了尽量避免使用载体蛋白，可以在LC-MS/MS分析前的样品制备和储存步骤中，使用具有高性能表面的样品储存容器来降低NSB的影响。Waters""MaxPeak HPS技术是一种专为提高分析物回收率和分析重现性设计的创新技术，能够最大限度减少分析物与表面相互作用，避免样品损失。 解决方案 本研究在LC-MS/MS分析前使用了具有MaxPeak HPS高性能表面的QuanRecovery样品板(部件号：186009184)储存样品，旨在减少多种mAb的非特异性结合。使用Xevo"TQ-XS质谱仪和mAb轻链保守区的共有MS/MS碎片离子(1329.85 m/z)， 在亚 基轻链水平定量检测人源mAb质量数QC标准品(部件号：186009125)中的阿达木单抗、西妥昔单 抗和NISTmAb(RM 8671)。色谱分离采用ACQUITYMUPLC"I-Class PLUS系统和BioResolve""RP色谱柱，450A， 2.7 um， 2.1x50 mm(部件号：186008944)。采用2.5 min内25%~30%B的缓梯度(流速0.4mL/min)分离生物治疗药物，流动相为 含0.1%甲酸的水和乙腈。 在方法开发阶段，分别使用QuanRecovery样品板和标准聚丙烯样品品储存三种mAb， 以评估这两种样品板储存完整mAb时，减少非特异性结合的效果。用纯溶液制备测试样品(100 ng/mL)并储存，另外，使用含载体蛋白的溶液制备样品，作为回收率100%的基准样品。如图1所示，样品在QuanRe-covery样品板中储存24h后几乎未发生非特异性结合，回收率达到84%~94%，而储存在标准聚丙烯样品板中的样品则发生了不同程度的非特异性结合，回收率只有23%~60%。 在上述结果的基础上，为进一步证明QuanRecovery样品板的性能，本研究从大鼠血浆中提取三种mAb， 储存在QuanRecovery样品板中，直至LC-MS/MS分析。如图2所示，使用与链霉亲和素包被磁珠(25pL)偶联的生物素化抗人Fc Ab(15uL)，对大鼠血浆(10pL)中的生物治疗药物进行免疫纯化。 生物治疗药物的亲和捕获 ..... 生物治疗药物碎片离子鉴定 生物治疗药物 母离子(m/z) 碎片离子(m/z) 碎片离子特征 阿达木单抗 1236.02 1329.85 P119-y96 西妥昔单抗 1236.81 NISTmAb 1288.84 ( 图2.定量分析大鼠血浆中mAb药物的样品制备例程及LC-MS/MS分析流程。大鼠血浆样品经过免疫纯化后，被还原为亚基，再进行烷基化以保持稳定。样品储存在QuanRecovery样品板中直至LC-MS/MS分析。采用mAb轻链保守区的共有MS/MS碎片离子(1329.85 m/z)定量阿达木单抗、西妥昔单抗和NISTmAb。 ) 然后使用ProteinWorks""还原/烷基化试剂盒(部件 号：18186008889)对亲和纯化后的样品(50pL)进行还原和烷基化处理。样品经二巯基苏糖醇还原为轻链和重链后，再用碘乙酰胺烷基化，以保持稳定。直接从QuanRecovery样品板里的经过处理的70 pL样品中取10pL进样至LC-MS/MS进行分析。利用经过优化的样品制备方法、储存条件和LC-MS/MS方法， 三种mAb的LLOQ均达到25~50ng/mL。校准曲线在25~100，000 ng/mL范围内呈线性(r²>0.99)，并且统计数据表明准确度(±15%)和精密度(CV<10%)均非常出色(表1)。尽管QuanRecovery样品板只在用于制备mAb样品时具有减少非特异性结合的作用，但该技术在此类型分子的分析中，尤其是低蛋白浓度条件下的分析中，优势非常明显。 生物治疗药物 曲线 (ng/mL) 权重 线性拟合 (r²) 准确度 (%)范围 阿达木单抗西 25-100，000 1/X² 0.997 94.5-104.3 妥昔单抗 25-100，000 0.996 95.7-105.5 NISTmAb 50-100，000 0.996 93.9-105.9 表1.取10 uL大鼠血浆进样分析得到的阿达木单抗、西妥昔单抗和NISTmAb的线性动态范围和标准曲线统计数据。 总结 处理易发生吸附的大分子时，必须注意减少非特异性结合。研究结果表明，在分析物浓度较低且样品量有限的情况下，具有MaxPeak高性能表面的QuanRe-covery样品板可以减少，甚至在某些情况下能够消除多种生物分子的非特异性结合。结合高选择性的样品制备策略、高性能的表面、兼容LC-MS分析的样品储存容器以及高灵敏度的LC-MS/MS方法，可以轻松达到生物治疗药物分析所需的定量下限。 ( 参考文献 ) ( 1 . L L agasse， H.A.D.； Alexaki， A.； Simhadri， V.L.； Katagiri， N . H.； Jankowski， W.； Sauna， Z .E.； Kimchi-Sarfaty， C.Recent Advances in (Therapeutic Protein)Drug Development. F1000Res.2017；6：113. ) ( 2 R . a be， M.； Verdes， D.； Seeger， S. Understanding Protein Adsorption Phenomenaat Solid Surfaces. Adv. Colloid Interface Sci. 2011， 162(1-2)，87-106. ) THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE." ( Waters， The Science of What’s Possible， QuanRecovery， MaxPeak， ACQUITY， UPLC， ProteinWorks， Xevo 和 B ioResolve 是沃特世公司的商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 ) 北京：海：州：港：沃特世公司。中国印刷。H TC-PDF 研究目的证明采用MaxPeak™ HPS (High Performance Surfaces，高性能表面)技术的QuanRecovery™ 样品板能够显著减少单克隆抗体药物的非特异性结合，从而提升分析方法性能。背景为了以更安全的剂量水平实现更好的疗效，新开发的生物治疗药物变得越来越复杂。为支持这类药物的开发，需要使用灵敏度和选择性更高的分析方法，达到更低的检测限。 而样品接触到样品板、样品瓶或移液枪头等实验室器皿时发生的非特异性结合(NSB)或吸附，是单克隆抗体(mAb)等疏水性生物大分子的分析中经常出现的问题。这种现象与分子的理化性质有关，通常在低浓度下更为明显。样品的非特异性吸附可能导致回收率降低、分析物损失、分析方法重现性差，最终导致分析达不到所需的检测限。因此，尽可能减少非特异性结合非常重要。结论处理易发生吸附的大分子时，必须注意减少非特异性结合。研究结果表明，在分析物浓度较低且样品量有限的情况下，具有MaxPeak高性能表面的QuanRecovery样品板可以减少，甚至在某些情况下能够消除多种生物分子的非特异性结合。结合高选择性的样品制备策略、高性能的表面、兼容LC-MS分析的样品储存容器以及高灵敏度的LC-MS/MS方法，可以轻松达到生物治疗药物分析所需的定量下限。