法医样品中滥用药物检测方案(气相色谱仪)

使用带玻璃毛超高惰性进样口衬管和GC/MS进行滥用药物的分析 应用报告法医毒理学 作者 摘要 Limian Zhao， Bruce Quimby 使用有效去活的玻璃毛，带玻璃毛的超高惰性衬管为滥用药物的筛选提供了优异的惰性、均匀的样品混合和汽化、非挥发性残留物捕集及对色谱柱和检测器的保护。 前言 美国 GC 进样口衬管是进样口系统的核心部件，样品在其中汽化，与载气混合并且进入毛细管色谱柱。由于玻璃毛能促进样品均匀混合和更好的定量，因此带玻璃毛的进样口衬管得到了广泛使用。玻璃毛提供了较大的表面积有助于液体样品的汽化。它也可以作为一个捕集阱，捕集样本中的非挥发性残留物，从而保护GC 色谱柱不受样品基基产生的负面影响。玻璃毛衬管也防止样羊在汽化前触及进样口底部从而减少样品的损失。安捷伦 MS 认证的带玻璃毛衬管能够提供满足一般应用要求的优良性能。然而，对于活性化合物分析的特殊应用，要得到最可靠的结果就需要使用具有超高惰性的衬管。 GC/MS 筛查方法对毒理学实验室是重要的。随着新药物和毒物不断出现，要进行筛选的目标化合物数以百计。因为这些化合物可使用 GC分析，采用电子轰击电电(EI)全扫描模式的 GC/MS 非常适合来完成这些分析[1]。为保留目标分析物，筛查样品通常需要最少的样品制备，甚至是没有经过净化的。然而，复杂基质样品，如血浆或尿液提取物， 会破坏分析柱和检测器的性能，缩短色谱柱的寿命并导致频繁的MS 源维护。因此，使用带玻璃毛的进样口衬管有利于保护整个 GC/MS 系统。 但是，如果带玻璃毛的衬管去活程度较差，就可能导致对碱性滥用药物中目标分析物的吸附或分解。如图1所示，这些药物通常含有杂原子，能与玻璃毛中的自由硅醇基 (Si-OH) 产生强烈相互作用[2]。由此产生的化合物的吸附和分解将导致色谱问题，如峰展宽或变形，峰拖尾，鬼峰以及响应变低。带玻璃毛衬管由于玻璃毛的大表面积和难以进行完全去活会放大这些负面影响。在法医/毒理学应用当中，如需得到准确、重现的理想色谱分离，正确而有效去活的带玻璃毛进样口衬管是必须的。 安捷伦超高惰性衬管去活技术极大的提高了玻璃毛去活的效率和耐用性。表面完全去活。这是带玻璃毛衬管第一次可以用于GC/MS分析碱性滥用药物。 带玻璃毛衬管采用安捷伦法医/毒理学分析测试标准品进行评估，样品中包括28种常见的和复杂的碱性药物化合物。化合物涵盖了各种保留洗脱范围的化合物，并含有不同类别的药物包括安非他命、生物碱和苯丙二嗪。 图1显示了一些分析物的化学结构。所有衬管测试同时使用GC/MS 扫描和 SIM 进行数据采集。使用5微克/毫升的标准品进行色谱评价。使用500纳克/毫升的标准品对(10倍稀释)超过50次进样的重复性进行评价。 实验部分 ( 化学品和试剂 ) 安捷伦 GC/MS 法医/毒理学分析测试混合标准品(部件号5190-0471)用于评估超高惰性带玻璃毛衬管的性能。HPLC 级甲苯和甲醇购自霍尼韦尔 B&J (Muskegon， MI， USA)， 乙腈 (ACN) 购自Sigma-Aldrich 公司(圣路易斯，密苏里州，美国)。内标物 (IS)购自 AccuStandard (纽黑文， CT， USA)，包含0.5毫克/毫升-D10，菲-D1o.三芳烷基磷酸酯，-D，2和-D12的丙酮溶液。 溶液和标样 原始校验标准品是比例为90/5/5的甲苯/甲醇/乙腈溶液。该空白混合溶剂由90毫升甲苯，5毫升甲醇和5毫升乙腈来制备，并作为试剂空白。5微克/毫升原始标准品直接进样，并用空白溶剂稀释10倍制成500纳克/毫升溶液。取4微升内标储备溶液加入到1毫升的标准品溶液中，如有需要，将样品中的内标浓度制成2微克/毫升。 仪器 所有测试均由配备 7683 B自动进样器和 5975C MSD 的安捷伦7890A气相色谱仪完成。 表1列出仪器条件。表2列出了流路耗材。表3列出对28种目标分析物的选择离子扫描条件。 溶剂延迟 1.4分钟 表2.流路备件 样品瓶 琥珀色螺纹口瓶(部件号5182-0716) 样品瓶盖 蓝色螺纹口瓶盖(部件号5182-0717) 样品瓶内插管 150微升玻璃带塑料支脚(部件号5183-2088) 隔垫 高级绿色不粘连11毫米隔垫(部件号5183-4759) 垫圈 0.4mm内径，85/15聚酰亚胺/按墨(部件号5181-3323) O型圈 不粘连衬管0型圈(部件号5188-5365) 微板流路控制技术 吹扫 Ultimate 两通接头(部件号 G3182-61580)， 内螺母(部件号 G2855-20530)， SilTite 金属垫圈 0.10-0.25mm 内径(部件号5188-5361) 进样口密封垫 带垫片进样口分流平板密封垫(部件号5188-5367) 进样口衬管 安捷伦超高惰性去活单细径锥不分流带玻璃毛衬管 (部件牛5190-2293) 表3. GC/MS用于28种碱性药物的 SIM 采集条件 采集 使用反吹系统，因为它能缩短含高沸点基质干扰物的分析时间、减少柱头修剪并降低 MSD 源的清洗[3.4]频率。仪器配置除了没有保留间隙，类似于图1B中以前的配置[4]。保留时间锁定 (RTL)是用来消除单个保留时间时如 SIM 基团的定时事件的再校正[5]。 结果与讨论 试验的目的是评估使用超高惰性去活带玻璃毛衬管和 GC/MS 筛查分析滥用药物的效果。使用安捷伦法医/毒理学分析测试标准品进行评估(见表3)。超高惰性带玻璃毛衬管性能由色谱性能、衬管间重复性和多次进样重复性决定。同时，与来自多个来生产商的带玻璃毛衬管进行测试比较。 安捷伦超高情性单细径锥带玻璃毛皮管(部件号5190-2293) 图2. 当使用其他同等衬管时，在 GC/MS SIM 色谱图中显示的分析滥用药物化合物的色谱问题及与超高惰性带玻璃毛衬管色谱图的比较。谱峰识别见表3，仪器条件见表1。5纳克测定标样进羊。A)峰展宽或峰变形， B)鬼峰，C)灵敏度差 色谱性能 碱性药物化合物的吸附或分解可能会导致各种色谱问题，包括峰展宽、峰变形、峰拖尾、鬼峰以及灵敏度降低。这些问题在使用检测标准品对衬管进行测试的实验中都能出现。早洗脱化合物如芬特明、甲基苯丙胺、MDA 和 MDMA 通常会出现峰形问题。由于灵敏度的降低，晚洗脱化合物如替马西泮可能消失。图2显示了使用类似衬管得到的问题色谱图与用带玻璃毛超高惰性衬管得到的色谱图的对比。如图2所示，进样5纳克，其他衬管去活导致如峰展宽或峰变形和响应严重降低等色谱问题。而安捷伦超高惰性去活衬管得到的相应色谱图则显示出更好的峰形及更高的响应。图3显示了进样5纳克测定标准品时，使用安捷伦超高惰性玻璃毛不分流衬管进行的 GC/MS 全色谱图。图3表明，带玻璃毛超高惰性衬管为所有测试的分析物提供了最好的色谱分离，即使是某些化合物也出现了小的拖尾峰或展宽。对六个超高惰性衬管进行了重复测试，每个均能提供相似的色谱性能，显示了优异的衬管间重复性。由于超高惰性衬管去活工艺为衬管和玻璃毛提供足够的惰性，因而能获得满意的色谱图，并防止滥用药物的吸附和分解。 ( 1.安非他明2.芬特明3.甲基安非他明4.尼古丁 5.亚甲二氧基安非他明 ) ( 6.亚甲二氧基甲基安非他明7.亚甲二氧基乙基安非他明8.哌替啶9.苯环利啶 ) ( 10.美沙酮11.可卡因 12.SKF-52 5 a13.奥沙西泮14.可待因15.劳拉西泮 ) ( 16.安定17.氢可酮18.四氢大麻醇19.羟考酮20.替马西泮21.氟硝西泮 ) ( 22.海洛因23.硝西半24.氯硝基安定25.阿普唑仑26.维拉帕米 ) 27.士的宁28.曲唑酮 图3. 使用带安捷伦超高惰性单细径锥不分流带玻璃毛衬管(部件号5190-2293)的 GC/MS分析法医/毒理学分析测试标样(5纳克测试标样进样)的色谱图。仪器条件见表1。所有分析物均获得了令人满意的峰形 衬管间重复性 为了定量评估衬管间的重复性，测试了四个不同批次的六根超高惰性衬管使用5微克/毫升和500纳克/毫升样品加入2微克/毫升内标。选择12种敏感化合物进行评估。计算了每个校准水平的响应因子(RFs)，平均 RF 值作为衬管间重复性测试的评估标准。见表4，结果表明四个不同批次的六个衬管具有优异的性能一致性， RSD 小于7%，除了替马西泮为11.7%。 表4. 衬管间重复性：12种敏感碱性药物化合物在六根超高惰性去活带玻璃毛毛管(部件号5190-2293)*上进行重复实验的平均 RF (5微克/毫升和500纳克/毫升)和RSD 值 衬管1衬管2衬管3衬管4衬管5衬管6 平均 化合物 (批次1)(批次1)(批次1)(批次2)(批次3)(批次4)RF RSD 甲基苯丙胺(3) 0.875 0.876 0.882 0.940 0.955 0.904 0.9053.8 MDMA (6) 0.807 0.789 0.783 0.848 0.874 0.841 0.8244.4 苯环利定(9) 0.494 0.510 0.494 0.488 0.509 0.521 0.5032.5 可卡因(11) 0.636 0.645 0.647 0.637 0.660 0.668 0.649 2.0 奥沙西泮(13) 0.050 0.055 0.052 0.055 0.062 0.057 0.055 7.6 可待因(14) 0.096 0.098 0.095 0.090 0.099 0.102 0.097 4.2 羟考酮(19) 0.073 0.071 0.070 0.076 0.082 0.080 0.0756.5 替马西西(20) 0.101 0.121 0.115 0.088 0.096 0.104 0.10411.7 海洛因(22) 0.097 0.099 0.096 0.095 0.100 0.102 0.0982.7 硝西泮(23) 0.038 0.032 0.037 0.034 0.037 0.036 0.0366.3 氯硝西泮(24) 0.035 0.035 0.034 0.032 0.034 0.033 0.0343.5 曲唑酮(28) 0.061 0.065 0.064 0.058 0.060 0.064 0.0624.4 峰面积分析物×浓度内标物 *RF= 峰面积内标物×浓度分析物 进样重复性和去活稳定性 通过连续50次进样1微升0.5微克/毫升的标准品测试多次进样重复性和去活稳定性。每10次进样后收集数据并计算RF值。50次进样后计算 RSD 值。表 5 显示所有碱性药物分析物0.5纳克的RSD 值。 由于在低浓度时的偏差比高浓度时的更大，因此使用 0.5 ng 柱上样量进行重复性测试。分析物的较高响应能隐藏一些偏差影响而产生较好的重现性。28种分析物中有22种的50次标准品溶液进样表现出优异的重现性，其 RSD 小于 20%。5种具有相对高的RSD (20-25%之间)，但是在0.5纳克进样水平上仍然是可接受的。替马西泮是一种极难分析的化合物，对于衬管惰性极度敏感。 表5. 去活稳定性：所有被测试的碱性药物化合物使用安捷伦超高惰性去活带玻璃毛衬管(部件号5190-2293)进行0.5纳克标准品的50次进样重复性实验(%RSD)(n=3) RSD (%) RSD (%) 化合物 50次进样 化合物 50次进样 安非他明 劳拉西泮 20.9 芬特明 安定 甲基苯丙胺 氢可酮 尼古丁 四氢大麻酚 8.5 亚甲二氧基苯丙胺 羟考酮 22.2 亚甲二氧基甲基苯丙胺2.2 替马西泮 59.9 亚甲二氧基乙基苯丙胺2.0 氟硝西泮 8.7 哌替啶 1.9 海洛因 10.7 苯环利定 15.6 硝西泮 11.2 美沙酮 氯硝西泮 12.0 可卡因 阿普唑仑 13.1 普罗地芬 维拉帕米 15.4 奥沙西泮 20.4 士的宁 11.0 可待因 20.5 曲唑酮 23.6 如图2所示，当使用一个效率低的去活衬管时，替马西泮(5纳克柱上进样)的响应几乎消失。图4可以清楚地看到，与其它相似衬管比较，安捷伦超高情性带玻璃毛衬管对替马西泮有最高的RF。这表明安捷伦超高惰性带玻璃毛衬管比竞争对手的同等衬管具有最高的惰性。 超高惰性衬管和其他同等衬管之间的替马西泮响应比较 图4. 超高惰性带玻璃毛衬管(部件号5190-2293)和其他同等衬管之间的敏感化合物(替马西泮)响应比较， RF计算是基于0.5纳克和5纳克标样进样的平均 RF 值。超高惰性衬管平均 RF 值设定为100%，其它衬管的平均 RF值按比例显示 随着样品进样量的增加，替马西泮的响应降低，这样产生了高的进样 RSD。这种现象在所有的测试衬管中都存在，并且其它衬管响应降低的更为明显。当替马西泮是目标分析物且浓度在 ppb 水平时，强烈推荐使用超高惰性带玻璃毛衬管，且每根衬管的分析不能超过 30个样品。 真正的基质样品分析 所有用于 GC/MS 分析的全血提取物由 NMS 实验室 (Willow Grove，PA)提供。全血样品通过溶液的液/液萃取、蒸发干燥及以1/10的体积再溶解于甲苯中制成。图5显示使用安捷伦超高惰性带玻璃毛衬管的 GC/MS分析 2 ppm 基质加入样品中的色谱图，对于早洗脱化合物的峰形和晚洗脱化合物的灵敏度能令人满意。有一些来自于基质的小干扰峰出现。 结论 安捷伦超高惰性带玻璃毛衬管对碱性滥用药物的分析表现出了优异的惰性。超高惰性带玻璃毛衬管为选定常见和复杂的碱性药物化合物提供了满意的色谱分析结果。衬管间性能表现出了优异的重复性，这些活性化合物 RF 值的平均 RSD 为5%。由于玻璃毛的去活效率和耐用性很高，使安捷伦超高惰性带玻璃毛衬管为法医和毒理学筛查提供了卓越的惰性。获得了由带玻璃毛衬管提供的诸如均一的样品混合和汽化、非挥发性残留物捕集以及对色谱 图5. 使用带安捷伦超高惰性单细径锥不分流带玻璃毛衬管(部件号5190-2293)的 GC/MS分析带全血基质的法医/毒物学分析检测标准品(2纳克进样)的色谱图。表1是仪器条件，表3是色谱峰识别。A)全扫描色谱图，B) SIM 色谱图。所有分析物均获得了满意的峰形和响应 柱和检测器的保护等优点，而不损害色谱或活性分析物的灵敏度。超高惰性带玻璃毛衬管是用于滥用药物筛查分析的最佳选择。 ( 参考 ) ( [1] B. Quimby， ，“使用带725个化合物DRS 数据库的GC/MS/NPD 系统提高法医毒物学筛查效率”安捷伦科技公司出版号5989-8582CHCN ) ( [2] N. Seyhan 和 D.C. Ege， “有机化学”健康和公司，19 8 4，124-136页 ) ( [3] M. Szelewski 和 B. Quimby， “复杂基质样品中快速检测农药的新手段”， 安 捷伦科技公司出版号5989-1716CHCN ) ( [4] P. Wylie 和 C. Meng， “安捷伦三重四级杆 GC/MS/MS分析175种农药残留”，安捷伦科技公司出版号5990- 3578CHCN ) ( [5] V . Giarrocco， B.Quimby， “保留时间锁定：概念和应用”，安 捷伦科技出版号，5966-2469CHCN ) Agilent Technologies 使用有效去活的玻璃毛，带玻璃毛的超高惰性衬管为滥用药物的筛选提供了优异的惰性、均匀的样品混合和汽化、非挥发性残留物捕集及对色谱柱和检测器的保护。GC 进样口衬管是进样口系统的核心部件，样品在其中汽化，与载气混合并且进入毛细管色谱柱。由于玻璃毛能促进样品均匀混合和更好的定量，因此带玻璃毛的进样口衬管得到了广泛使用。玻璃毛提供了较大的表面积有助于液体样品的汽化。它也可以作为一个捕集阱，捕集样本中的非挥发性残留物，从而保护GC 色谱柱不受样品基质产生的负面影响。玻璃毛衬管也防止样品在汽化前触及进样口底部从而减少样品的损失。安捷伦MS 认证的带玻璃毛衬管能够提供满足一般应用要求的优良性能。然而，对于活性化合物分析的特殊应用，要得到最可靠的结果就需要使用具有超高惰性的衬管。GC/MS 筛查方法对毒理学实验室是重要的。随着新药物和毒物不断出现，要进行筛选的目标化合物数以百计。因为这些化合物可使用GC 分析，采用电子轰击电离（EI）全扫描模式的GC/MS 非常适合来完成这些分析。为保留目标分析物，筛查样品通常需要最少的样品制备，甚至是没有经过净化的。然而，复杂基质样品，如血浆或尿液提取物，会破坏分析柱和检测器的性能，缩短色谱柱的寿命并导致频繁的MS 源维护。因此，使用带玻璃毛的进样口衬管有利于保护整个GC/MS 系统。