细胞中单克隆细胞活性检测方案(流式细胞仪)

探讨---在稳定株筛选过程中，如何提高单克隆细胞的活性 最近，单抗市场又迎来了一个关注的热潮。实验室的技术人员以及各大设备厂家，也都逐渐把目光和精力都投向了如何提高单抗药物研发和生产的效率问题上了。在这一层面，各大单抗研发生产企业似乎都在进行赛跑。谁在整个流程中领先一小步，那么极有可能在整个单抗药物市场中赢得先机。 在这里，今天我们要讨论的是关于在稳定株筛选过程中，如何提高单克隆细胞的活性。大家都想把高产的细胞株顺利地挑选出来，然后让其稳定地生长、增殖。真正做实验的人员才会发现，其实这整个过程远远没有流程设计时那么简单。这里会涉及到一下几个问题：其一，挑选的方法。目前，实验室里经常用到的单克隆细胞筛选方法有有限稀释法，半固体培养基挑选法(例如 Clone Pix)， 以及流式细胞术挑选法等。这其中有好多需要关注的点，例如挑选细胞的参数，挑选方法本身对细胞的损伤等。所以说，一个高效的筛选方法绝对能让工作效率提高好几倍。 有限稀释法是目前最常用的一种常规武器，这种方法筛选细胞最大的好处就是基本上不会伤害细胞。整个过程中细胞所经历的，也仅仅是在移液枪头中的短暂停留，因此几乎是零损伤。不过，这种方法的弊端也是显而易见，就是效率问题。首先是铺板效率，虽然不到一分钟能将一块96孔板铺满，但是一般来说96孔中有细胞的概率在2/3左右(按照细胞浓度会有所差别)，其中单个细胞的概率就更小了。这些细胞要经过一段时间的生长，抗体分泌之后，在其上清液中去检测抗体含量。流程耗时太长，且效率低下。但是在没有更先进的设备的时候，这还是目前最好的选择。 半固体培养基挑选法。在半固体的培养基上，以一定的密度“种上”细胞，并且让细胞生长并分泌抗体。经过一段时间之后，原先细胞的周围会有抗体产生，然后对整个体系进行 荧光抗体染色，并且通过荧光显微设备检测到荧光最强的“一团”，将其“挖”出。接着，经过一些特定的处理环节，将细胞置于悬浮培养环境中，让其生产抗体。这是前几年最流行的挑选方法，优势非常明显，能直观的检测生产的抗体产量。但是后来很多使用者发现，刚从半固体培养基“挖”出来的细胞，不适合直接培养生产抗体，而是需要在养两周以上进行“排毒”。因为之前所用的荧光抗体浓度较高，对细胞还是有一定的毒性。另外，很多用户发现，由于生长环境的不同，原先在半固体培养基上挑选得到的高产细胞，在后续悬浮的培养环境中并不高产。关键是这个方法无法直接获得单克隆，后续还是需要通过有限稀释等方式进行单细胞培养。 流式细胞术挑选法。流式细胞分选仪是挑选细胞的不二法宝，在细胞分析分选当中占有重要一席。在很多抗体研发企业中，也都有用到流式细胞仪来挑选高产细胞株。的确，流式细胞仪在这一应用领域有其独特优势，例如分析精确(挑选高产细胞)，分选快速(每秒上万个细胞)。不过，很多用户发现虽然流式在这方面挑选效率很高，但是分下来的细胞活性却很低。这和流式细胞术的原理有着极大地关系。流式细胞仪在分选过程中，整个内部体系的压力很大，一般有2~3个大气压强，细胞在这样的环境中容易损伤。高频震荡出细小液滴的过程对细胞也是一种伤害。最后是 1nl左右的液滴高速打到板子中的过程，对细胞是个不小的碰撞。 其二，细胞状态。挑选的过程对细胞会有所伤害，但是细胞本身的状态对筛选之后的细胞生长和增殖也是至关重要。细胞在筛选前已经处于活性较差的状态，在分离成单细胞之后，更不能奢望它能有所改观。另外，传代次数越多，，一一般单细胞在生长的概率越小。所以，有时候我们在寻找或者比较筛选方法的时候，细胞的状态也需要考虑进去。 其三，培养基的选择。动物细胞本身都是“群居”的，单个生长本身就有很大的难度。细胞在生长过程中会分泌很多复杂的生长因子。这些生长因子会促进细胞的生长和增殖，但 是单个细胞生长时，这种促进作用几乎没有了。很多细胞其实在分离出来的时候，明明有着很好的活性，但是却偏偏不增殖。这类细胞它会在体积上慢慢变大，长大到一定程度直接就“自爆”了。因此，一个好的 conditioned medium，就会成为每家培养单细胞的秘密武器。 Namocell 致力于单细胞的分离分选。独创的微流体单细胞分离技术在抗体研发中有着很好的应用。首先， Namocell单细胞分离仪的内部压力只有不到 2 psi， 整个分选过程无需高频震荡，保证了细胞活性；其次，用到激光激发和荧光接收的原理，能够对细胞进行识别和筛选；最后，不到 1min 即可分选一块96孔板，分选速度快。另外， Namocell 的专业技术人员将根据多年的实战经验，提供最优的分选条件，最大限度保证分选细胞的活性以及生长能力。 探讨---在稳定株筛选过程中，如何提高单克隆细胞的活性      最近，单抗市场又迎来了一个关注的热潮。实验室的技术人员以及各大设备厂家，也都逐渐把目光和精力都投向了如何提高单抗药物研发和生产的效率问题上了。在这一层面，各大单抗研发生产企业似乎都在进行赛跑。谁在整个流程中领先一小步，那么极有可能在整个单抗药物市场中赢得先机。在这里，今天我们要讨论的是关于在稳定株筛选过程中，如何提高单克隆细胞的活性。大家都想把高产的细胞株顺利地挑选出来，然后让其稳定地生长、增殖。真正做实验的人员才会发现，其实这整个过程远远没有流程设计时那么简单。这里会涉及到一下几个问题：其一，挑选的方法。目前，实验室里经常用到的单克隆细胞筛选方法有有限稀释法，半固体培养基挑选法（例如Clone Pix），以及流式细胞术挑选法等。这其中有好多需要关注的点，例如挑选细胞的参数，挑选方法本身对细胞的损伤等。所以说，一个高效的筛选方法绝对能让工作效率提高好几倍。有限稀释法是目前最常用的一种常规武器，这种方法筛选细胞最大的好处就是基本上不会伤害细胞。整个过程中细胞所经历的，也仅仅是在移液枪头中的短暂停留，因此几乎是零损伤。不过，这种方法的弊端也是显而易见，就是效率问题。首先是铺板效率，虽然不到一分钟能将一块96孔板铺满，但是一般来说96孔中有细胞的概率在2/3左右（按照细胞浓度会有所差别），其中单个细胞的概率就更小了。这些细胞要经过一段时间的生长，抗体分泌之后，在其上清液中去检测抗体含量。流程耗时太长，且效率低下。但是在没有更先进的设备的时候，这还是目前最好的选择。半固体培养基挑选法。在半固体的培养基上，以一定的密度“种上”细胞，并且让细胞生长并分泌抗体。经过一段时间之后，原先细胞的周围会有抗体产生，然后对整个体系进行荧光抗体染色，并且通过荧光显微设备检测到荧光最强的“一团”，将其“挖”出。接着，经过一些特定的处理环节，将细胞置于悬浮培养环境中，让其生产抗体。这是前几年最流行的挑选方法，优势非常明显，能直观的检测生产的抗体产量。但是后来很多使用者发现，刚从半固体培养基“挖”出来的细胞，不适合直接培养生产抗体，而是需要在养两周以上进行“排毒”。因为之前所用的荧光抗体浓度较高，对细胞还是有一定的毒性。另外，很多用户发现，由于生长环境的不同，原先在半固体培养基上挑选得到的高产细胞，在后续悬浮的培养环境中并不高产。关键是这个方法无法直接获得单克隆，后续还是需要通过有限稀释等方式进行单细胞培养。流式细胞术挑选法。流式细胞分选仪是挑选细胞的不二法宝，在细胞分析分选当中占有重要一席。在很多抗体研发企业中，也都有用到流式细胞仪来挑选高产细胞株。的确，流式细胞仪在这一应用领域有其独特优势，例如分析精确（挑选高产细胞），分选快速（每秒上万个细胞）。不过，很多用户发现虽然流式在这方面挑选效率很高，但是分下来的细胞活性却很低。这和流式细胞术的原理有着极大地关系。流式细胞仪在分选过程中，整个内部体系的压力很大，一般有2~3个大气压强，细胞在这样的环境中容易损伤。高频震荡出细小液滴的过程对细胞也是一种伤害。最后是1nl左右的液滴高速打到板子中的过程，对细胞是个不小的碰撞。其二，细胞状态。挑选的过程对细胞会有所伤害，但是细胞本身的状态对筛选之后的细胞生长和增殖也是至关重要。细胞在筛选前已经处于活性较差的状态，在分离成单细胞之后，更不能奢望它能有所改观。另外，传代次数越多，一般单细胞在生长的概率越小。所以，有时候我们在寻找或者比较筛选方法的时候，细胞的状态也需要考虑进去。其三，培养基的选择。动物细胞本身都是“群居”的，单个生长本身就有很大的难度。细胞在生长过程中会分泌很多复杂的生长因子。这些生长因子会促进细胞的生长和增殖，但是单个细胞生长时，这种促进作用几乎没有了。很多细胞其实在分离出来的时候，明明有着很好的活性，但是却偏偏不增殖。这类细胞它会在体积上慢慢变大，长大到一定程度直接就“自爆”了。因此，一个好的conditioned medium,就会成为每家培养单细胞的秘密武器。综上所述，在细胞株筛选过程中要提高单克隆细胞的生长比例，内因和外因都非常重要：内因是指细胞自身状态；外因是指分离单细胞的方式以及培养基方案。Namocell的专业技术人员将根据多年的实战经验，提供最优的分选条件，最大限度保证分选细胞的活性以及生长能力。