食品中非法添加色素检测方案(薄层色谱仪)

CAMA高效薄层色谱实践 CAMAL 3CAMAG CBS 第 103期中文版(2009.9)|瑞士卡玛中国技术支持中心|www.camag-china.com|www.nikyang.com HPTLC 同时测定食品中的13种非法添加色素的含量 从左至右： Matthias Bleisch 和 Dr. Helmut Kandler 苏黎世国家实验室是瑞士苏黎世州的官方食品控制机构。为了保证食品安全，该实验室积极采纳各种新的及改进的分析方法，但前提是方法必须可靠。几年来食品分析实验室主任Helmut Kandler博士和他的团队一直致力于将 HPTLC方法作为其它技术的有益补充。在和位于瑞士 Muttenz 的 CAMAG 实验室的 Eike Reich 博士和 Valeria Widmer 的协作下，，一种用来检测调味品中非法添加色素的快速和可靠的分析方法被发展并通过了方法学验证。 简介 近年来多个欧洲国家都在市场上的红辣椒粉中发现了偶氮类染料苏丹红I-V。这些红色和橙色的染料都属于致癌物，因此被禁止应用于食品当中。为了冒充高质量的产品，这些掺伪物被人为加入以改善调味品的天然色泽。 对照品溶液的制备 将各20 mg的苏丹1、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、苏丹红 7B、苏丹红G、苏丹红 G、苏丹红7B、对位红、FD&C橙色2号、甲基黄、橘红2号、甲苯胺红和分散橙11号分别溶于丙酮和乙腈中，并定容至100 mL (200 pg/mL 储备液)。将待检测的5mL各储备液混合并蒸干(50℃，120 hPa)，将渣用乙腈 10 mL溶解(色素的浓度：各100 pg/mL在对照品混合液 MIX 1 和 MIX2中)。 供试品的制备 5g均质后的样品加50 mL 乙腈搅拌提取 10 min，继而过滤。在10 mL中的滤液中逐滴加入FeCl；( 5 mg/mL的乙腈溶液)，直至溶液颜色由红色转为绿色(大约需要0.3-0.8 mL)。将溶液蒸干，残渣加1mL碱性二氯甲烷( 250 mL 二氯甲烷中加入10 mL 25%氨水震摇分层)溶解，并通过 SPE 硅胶小柱纯化。将洗脱液蒸干，残渣加1mL乙腈溶解。 掺标样品 在100mL锥形瓶中加入5g未受污染的空白样品，再各加加0.5、1.5、3、4.5及6mL的混合对照品 MIX1和 MIX2。加乙青定容至50mL， 并按上法操作(样品掺标的浓度在10-120 mg/kg)。 ( 薄层板 ) HPTLC RP18 F254高效预制薄层板， 10x10 cm 和20x10cm， 德国Merck。 点样 采用 Linomat 5 进行条带状点样，条带宽8mm，原点距离底边8mm， 距离侧边最小 15mm， 轨道间距最小10 mm， 点样量：样品10pL，对照照1-12 pL(1：10稀释后点3-15uL)。 色谱条件 在全自动展开仪ADC 2 中进行，以乙腈-25%氨水为展开剂，展开距离60 mm(从薄层板底边计)。 成像 采用 DigiStore 2 或 TLC Visualizer 薄层成像系统在白光下以反射模式进行拍照和存档。 薄层光密度扫描 采用 TLC Scanner 3多波长扫描模式和winCATS工作站软件在各个染料的最大吸收波长下进行扫描测定。 Mix1 RF Rrel Rrei RF Mix 2 Para Red 0.60 1.22 1.38 0.66 Disp. Orange 11 Citrus Red 2 0.54 1.10 1.23 0.59 Butter Yellow SudanI* 0.49 1.00 1.10 0.53 Toluidine Red Sudan Il 0.33 0.67 1.00 0.48 Sudan Red G" Sudan III 0.23 0.47 0.83 0.40 FD&C Orange 2 Sudan IV 0.16 0.33 0.44 0.21 Sudan Red 7B3 - - 0.31 0.15 Sudan Red B 色素 入max(nm) 色素 入max(nm) Sudanl 495 Sudan Reg G 514 Sudan II 508 Sudan Red B 533 Sudan III 523 FD&C Orange 2 502 Sudan IV 453 Para Red 522 Citrus Red 2 529 Disperse Orange 11 488 Sudan Red 7B 551 结果和讨论 样品提取环节对于分析来讲非常关键。通过添加三价铁的盐酸盐溶液将调味品中的天然色素氧化为无色衍生物从而达到了选择性地提取合成色素的目的。随即的 固相萃取纯化步骤将样品的基质干扰进一步降低。 氧化步骤对色谱图的影响 A：不进行氧化；B：采用FeCls进行氧化；1，1：红辣椒空白样品； 2，2：红辣椒空白样品加入50 mg/kg 量的混标MIX 2； 3，3：咖 喱空白样品；4，4：咖喱空白样品加入50 mgkg 量的混标MIX1。 该方法作为日常检测手段经过了方法学验证，包括回归工作曲线、加样回收率、精密度、重现性和检测限。初始的低浓度(30-50ng/斑点)和高浓度(100-1200ng/斑点)工作曲线通过 Michaelis-Menten 2回归函数加以建立。 混标MIX1色谱图 最低和最高浓度被分别点样5遍(板中央)，不同水平的工作曲线浓度被重复点样2次(板左侧和右侧) 加样回收率测试在加入10- 120 mg/kg 量的混标的红辣椒和咖喱中进行。样品的回归曲线和标准品溶液的回归曲线具有可比性。降低的值和样品制备过程中成分的少量损失呈现相关。在少数情况下，由于部分基质的干扰(如检测红辣椒中的苏丹Ⅰ)导致二者的结果存在一定的偏差。 LOD(可见光) LOD(光密度法) 咖喱 约3 mg/kg(例外： 5 mg/kg 1-3mg/kg 苏丹1， 7 mg/kg 甲基黄和 13 (例外：7 mg/kg 分mg/kg 分散橙) 散橙) 辣椒 约3mg/kg(例外： 5 mg/kg1-3mg/kg苏丹1和甲基黄， 12 mg/kg 分 散橙) amount [ng] MIX1所有成分在低浓度的工作曲线 13种色素的工作曲线 最低含量的 最高含量的 SDV (MIX1，2) RSD%值 RSD%直 (%) 低含量工作曲线 2.3-6.7 0.5-2.9 1.2-3.8 高含量工作曲线 0.7-6.4 0.3-4.3 0.5-4.8 对市售商品的调查显示受过污染的调味品样品中所含非法添加色素的含量一般都高于 100 mg/kg。之所以没有低于这个剂量水平的受污染样品被发现是由于较低的染料浓度达不到为产品增加色泽的目的。综上所述，本文的 HPTLC 方法可用来对调味品中所含有的非法添加色素进行快速、灵敏和可靠的分析。 对基质效应的观察结果显示可靠的加样回收率是难以达到的。因此不再进一步针对每个色素成分的加样回收率进行测定。 在进行方法精密度测定时，在6个红辣椒和咖喱的样品中分别掺入50 mg/kg 的混标溶液MIX1 和MIX2。并且采用加样回收率对含量进行校正。 回归曲线的比较：标准品溶液苏丹红B(红色曲线)和咖喱粉中的苏丹红B(蓝色曲线) ( [1] H. Kandler， M. Bleisch， V. Widmer， E . Reich， J. Liq.Chromatogr. Related Technol. 3 2 (2009) 1 2 73 ) 实际最低检测限(LOD)通过掺标样品的加样回收率进行校正(范围1-17 mg/kg)。与肉眼观察相比，光密度扫描的 LOD 值要降低1倍。 Contact： Dr. Eike Reich， CAMAG Laboratory， Sonnenmattstr. 11，4132 Muttenz， Switzerland. eike.reich@camag.com