乳及乳制品中蛋白质检测方案(蛋白测定仪)

分析化学(FENXI HUAXUE) 仪器装置与实验技术Chinese Journal of Analytical Chemistry第10期1496~1500第39卷2011年10月 冯旭东等：蛋白质快速检测仪测定乳及乳制品中蛋白质第 10期1497 DOI： 10.3724/SP.J. 1096.2011.01496 蛋白质快速检测仪测定乳及乳制品中蛋白质 冯旭东' 安卫东² 丁毅' 于爱民' 刘静’高德江’ 王智宏‘ 于永*4 '(吉林大学化学学院，长春130012) ²(吉林省计量科学研究院，长春130022) (长春吉大·小天鹅仪器有限公司，长春130012) “(吉林大学仪器科学与电气工程学院，长春130012) 摘 要 采用研制的蛋白质快速检测仪，系统地考察了温度、时间和干扰物质等因素对蛋白质测定的影响及检测仪的重复性，并将检测仪应用于新鲜乳、纯牛奶、奶奶饮料(核桃、燕麦、红枣)牛初乳、奶粉、豆奶粉、豆浆粉和鸡蛋等样品中蛋白质的定量测定。实验结果表明，在17~40℃条件下，蛋白质试剂与蛋白质在1 min 内即可完成反应，整个蛋白质含量测定过程仅需 5~10 min，测定结果的精密度(RSD)小于1%，与凯式定氮法测定结果和标准物质比较，测定结果的相对误差均小于5%，且不受三聚氰胺、尿素、甘氨酸和硝酸铵等非蛋白氮的干扰，表明此仪器具有较好的准确度和重复性，可应用于乳及乳制品中蛋蛋质质快速定量测定。 关键词 蛋白质快速检测仪；乳及乳制品；快速测定 1 引 言 蛋白质是生命现象中最基本的物质基础，具有调节生理功能，充当药物分子、维生素、矿物质与微量元素的载体等功能。食用乳及乳制品是人体摄人蛋白质的重要途径之一。为了保证乳及乳制品的质量，我国在《生乳安全标准》《GB/T 5410-2008乳粉》和《NY 5045-2001 无公害食品生鲜牛乳》等标准中都明确规定了乳及乳制品中蛋白质含量要求。但一些不法分子为了获取经济利益，向乳制品中添加含氮量高的无机物质(如三聚氰胺、尿素、硝酸铵等)以提高蛋白质的含量，严重影响乳制品的质量和人们的身体健康。有关乳及乳制品中蛋白质含量不达标所引起的食品中毒事件时有发生，乳制品安全引起了社会极大关注。我国和国际上均出台了一系列标准的乳及乳制品中蛋白质含量的测定方法，如凯氏定氮法1.2]、斯马斯燃烧法[3~51等。凯氏定氮法是我国用于蛋白质测定的常规检测方法，它是通过样品消解将样品中所有氮元素转化为氨，通过 HSO. 或 HCl标准溶液进行滴定，实现样品中蛋白质的测定，完成一个样品的整个分析过程至少需要2h。从其原理可知，样品消解后所有氮元素均转化为氨，故该法无法区分蛋白质氮与非蛋白质氮。2001年，国际标准化组织和国际乳品联合会发布了乳制品中非蛋白氮的测定标准方法，该法提出了蛋白氮和非蛋白氮分离方法，弥补了凯氏定氮法不能能分蛋白白和非蛋白氮的缺陷，该方法我国于2008年同引引用。杜马斯燃烧法是国际上常用于蛋白质含量测定的方法。样品燃烧后生成的氮氧化物在钨上还原为分子氮，分子氮由二氧化碳载气运送到 TCD 热导检测器，氮含量引发一种电子测量信号，经过标准物质独立校正被测样品中中含量，然后转换为蛋白质的含量。从原理上看，如不对样品进行预处理，该方法与凯氏定氮法同样也无法区分蛋白质氮和非蛋白质氮。本研究开发出一种能够对乳及乳制品中蛋白质快速、准确、定量且不受非蛋白质氮干扰的蛋白质快速检测仪[8. 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 GDYN-200S 蛋白质快速检测仪(长春吉大·小天鹅仪器有限公司)； Setra BL-120S分析天平(美国西特 Setra 公司)；奶粉中蛋白质标物(BW3832-1/ BW3832-2/BW3832-3)购于国家标准物质研究中心；蛋 ( 2011-07-20收稿；2011-08-16接受 ) ( 本文系吉林省科技发展计划项目(No.20096016)和质检公益性行业科研专项(No.200810471)资助 ) ( * E- mail： y uyong@jlu.edu.cn ) 白质试剂(主成分为偶氮染料，长春吉大·小天鹅仪器有限公司)：将蛋白质式剂全部转移至2L蛋白质试剂分取器，用水稀稀至2L， 备用。 2.2 实验方法 2.2.1 样品前处理 (1)牛奶 准确称取 1.000g牛奶于塑料样品杯中，注入40mL 蛋白质试剂，搅拌1 min， 以 12000 r/min 离心3 min， 上清液为待测溶液。(2)奶粉分 准确角取10.000 g奶粉于塑料样品杯中，加入90 mL 蒸馏水，搅拌3 min， 此溶液为奶粉稀释液。其它步骤同牛奶蛋白质测定步骤。(3)鸡蛋取2.000g搅拌均匀的生鸡蛋液，加入1.0 mL 鸡蛋蛋白质前处理试剂和7 mL蒸馏水，摇摇，准确称取0.500g上述处理后鸡蛋样品于塑料样品杯中，注入40 mL 蛋白质试剂，搅拌1 min， 分取搅拌后溶液，以12000 r/min 离心 3 min， 上清液为待测溶液。 2.2.2 测量 以蒸馏水为空白，通过 GDYN-200S 蛋白质快速检测仪检测蛋白质试剂反应前后吸光度，根据仪器内置数据处理系统计算样品中蛋白质的含量。 3 蛋白质快速检测仪原理和结构 3.1 仪器的分析原理 将某些有机试剂适量加入到含有蛋白质的溶液中时，有机试剂与蛋白质相互作用生成不溶性化合物(这些有机试剂可称为蛋白质试剂)，离心分离不溶性化合物，未与蛋白质反应的有机试剂仍存在溶液中。通过定量加人的有机试剂，借助蛋白质快速检测仪检测有机试剂吸光度的变化，可测定出样品中蛋白质的含量。因为溶液吸光度与有机试剂的浓度成正比，当蛋白质存在时，溶液中有机试剂浓度降低，其溶液吸光度也降低，降低程度与蛋白质浓度相关。 3.2 蛋白质快速检测仪结构 蛋白质快速检测仪主要由样品称量、显色分离和测量3部分构成，其中称量部分由分析天平完成，通过数据线直接将数据传输到 GDYN-200S 蛋白质快速检测仪。蛋白质检测仪结构如图1所示，主要由 光源，比色池、检测器、硬件驱动系统和显示系统等构成。 采用中心波长为 483 nm 的超高亮发光二极管(LED)10]源光源，该光源又作为单色器，使用寿命为10°h。与传统便携式分光光度计相比，仪器无需光栅和棱镜等分光器件，简化了仪器光路系统，降低成本，增加了仪器的抗震和抗干扰能力。蛋白质试剂在 483 nm 处具有较大摩尔吸光系数，如采用传统的光程为1 cm 比色池，需稀释后才能测量。为了减少样品稀释引起的测量误差，该仪器的比色池采用 图1 仪器硬件结构示意图 Fig. 1 Schematic diagram of lactose fast 光程仅为2 mm流通式结构，借助注射器实现被测样品的引人。检测器为 TSL 系列集成光频转换器，可直接将光信号转化为频率信号实现光频数字化检测。微控制器采用32位 ARM AT91SAM7S256 作为为器的逻辑控制核心，可直接对 TSL 系列光频转换器的输出频率进行计数，从而得到透射光的强度值。程序采用ARM 汇编与C语言吾写，开发工具为 GNU arm-elf-toolchain， 嵌入式控制软件整体流程如图2所示。 4 结果与讨论 4.1 蛋白质试剂光谱图 采用紫外可见分光光度计对蛋白质试剂及其与蛋白质反应离心后的上清液进行光谱扫描(图3)。从图3可见，蛋白质试剂在 483 nm 处具有较强的特征吸收(曲线1)。当样品中蛋白质与试剂发生特异性反应，用紫外可见分光光度计扫描上清液，发现上清液(即未反应的蛋白质试剂)在483nm处仍有一个较强的特征吸收峰(曲线2)，其吸收峰形状和位置未发生改变，但吸光度强度明显降低，且随着蛋白 图2 嵌入式控制软件流程图 Fig.2Flow charts of embedded software 质含量的增加其降低程度增大。同时发现，蛋白质试剂反应前后吸光度变化值与待测物质中蛋白质的含量具有一定关系，即，其中，为蛋白质试剂反应前后吸光度变化值；为蛋白质浓度；为吸收系数，即表示蛋白质浓度变化1个单位引起的吸光度值的变化。据此，本研究建立了蛋白质的快速测定方法。检测仪选用483 nm 的超高亮发光二极管作为光源。 4.2 温度对测定结果的影响 考察了不同温度对蛋白质含量测定的影响。如表1所示，在温度17~40℃范围内，温度对 GDYN-200S 蛋白速快速检测仪测定样品中蛋白质(标准值3.07%)无影响。 表1 温度对测定结果的影响 Table 1 Effect of temperature on determination results 温度 Temperature(℃) 17 20 25 30 35 40 蛋白质含量 Protein(%，n=3) 3.08 3.06 3.07 3.07 3.07 3.06 图3 溶液吸收光谱图 4.3 时间对测定结果的影响 Fig. 3 Absorption spectra of protein reagent in theabsence (1) and presence (2) of protein 考察了蛋白质试剂与蛋白质反应时间对测定结果的影响，结果表明，在室在条件下，搅拌1 min 样品中的蛋白质可与蛋白质试剂发生特异性反应；同时考察蛋白质试剂反应后上清液的稳定性，由表2可见，在2h内测定的A和B两牛奶样品的蛋白质含量保持不变。整个蛋白质测定过程仅需5~10 min，与凯氏定氮法2~3h相比，检测时间显著缩短。 表2 时间对蛋白质含量测定结果的影响 Table 2Effect of time on determination results 时间 Time( min) 0 5 10 20 30 40 50 60 120 240 Milk A (%) 3.23 3.23 3.23 3.25 3.23 3.23 3.22 3.22 3.20 3.18 Milk B(%) 3.74 3.74 3.74 3.76 3.73 3.72 3.71 3.75 3.72 3.71 4.4 测定结果的重复性 考察了 GDYN-200S 蛋白质快速检测仪对样品测定结果的重复性。对A、B两牛奶样品蛋白质含量重复测定11次，其测定结果的精密度分密为0.9%和0.5%，表明 GDYN-200S 蛋白质快速检测仪测定结果具有良好的精密度。 4.5 干扰试验 从蛋白质检测仪原理可知，检测信号为蛋白质试剂反应前后吸光度变化值。向蛋白质试剂中添加一定量的三聚氰胺、尿素、甘氨酸、硝酸铵等非蛋白氮物质，以验证非蛋白氮是否干扰蛋白质的测定，结果如表3所示。通过紫外-可见分光光度计扫描可知，三聚氰胺、尿素、甘氨酸、硝酸铵等添加物在483 nm 处均无吸收，当加入蛋白质试剂时，未见不溶性化合物生成，蛋白质试剂溶液吸光度也未发生变化，表明三聚氰胺、尿素、甘氨酸、硝酸铵等未与蛋白质试剂反应，不影响蛋白质的测定。向鲜奶样品中添加三聚氰胺，结果如表4所示，当三聚氰胺添加量≤0.1 g/20 mL 时，添加与不添加三聚氰胺对测定结果无影响；但添加量过高时，蛋白质测定结果偏低，这是因为随着三聚氰胺添加量的逐渐增加，蛋白质在添加了三聚氰胺的样品中的质量分数逐渐降低所致。 表3 干扰实验结果 Table 3 Effect of foreign substance on determination results 无 _聚氰胺 尿素 甘氨酸 硝酸铵 No Melamine Urea Glycine Ammonium nitrate 添加量 Amount(g/L) 0.0 0.2 0.6 1.0 0.2 0.6 1.0 0.2 0.6 1.0 0.2 0.6 1.0 吸光度 Absorbance 1.008 1.011 1.008 1.008 1.010 1.013 1.013 1.015 1.005 1.014 1.0111.009 1.012 表4三聚氰胺对测定结果的影响 Table 4 Effect of melamine on determination results 序号 合成样品 蛋白质含量 序号 合成样品 蛋白质含量 No. Synthetic sample Protein(%) No. Synthetic sample Protein (%) 1 20 mL 鲜奶 Raw milk 2.43 4 20 mL 鲜奶+0.15g三聚氰胺Raw milk+Melamine 2.27 2 20 mL 鲜奶+0.05g三聚氰胺 Raw milk+Melamine 2.43 5 20mL鲜奶+0.20g三聚氰胺Raw milk+Melamine 2.15 3 20 mL 鲜奶+0.10g三聚氰胺 Raw milk+Melamine 2.44 4.6 蛋白质快速检测仪的应用 将研制的 GDYN-200S 蛋白质快速检测仪应用到新鲜乳、市售纯牛奶、牛奶奶料(核桃、燕麦、红枣)、奶粉(包括牛初乳粉)、豆浆粉、豆奶粉和鸡蛋等500个样品中蛋白质的定量测定，并与凯氏定氮法进行比较，同时测定了3种奶粉中蛋白质标准物质，部分结果见表5所示。从检测数据可知，与凯氏定氮法测定结果(依据国家标准方法7分别测定样品中的总氮和非蛋白氮，二者差减后计算出样品中真实的蛋白质含量)与标准物质相比，其相对误差均小于 5%。 表 5 GDYN-200S 蛋白质快速检测仪的应用 Table 5 Application of protein fast analyzer GDYN-200S 序号 品种 凯式定氮· GDYN-200S 相对误差 No. Style Kjeldahl method"(%) protein(%) Relative error (%) 1 新鲜奶 Raw milk 3.86 3.78 2.3 2 纯牛奶 Pure Milk 3.13 3.12 0.2 3 核桃牛奶Walnut Milk 2.19 2.19 -0.1 4 燕麦牛奶 Oat Milk 2.26 2.29 -1.2 5 红枣牛奶 Jujube Milk 2.38 2.41 -1.21 6 奶粉 Milk Powe 15.28 15.75 3.1 7 标准物质(BW3832-1) Protein in Milk Powder 17.44 17.29 一0.86 8 标准物质(BW3832-2) Protein in Milk Powder 22.84 23.69 3.72 *总氮减去非蛋白氮计算而得(Protein amount is calculated by the difference between crude protein nitrogen and non protein-nitrogen)。 从实验结果可知，蛋白质试剂可快速定量与样品中蛋白质发生反应(1 min)，且能稳定 2 h， 单一样品全程检测周期仅需5~10 min；因蛋白试试剂仅与蛋白质氮特异性反应，避免了三聚氰胺、按素、甘氨酸和硝酸铵等非蛋白氮的干扰；同时该仪器和方法操作简单，避免了传统检测方法消解、蒸馏和滴定等复杂步骤，适用于实际样品中的蛋白质定量检测。 ( References ) ( 1 G B/T 5009.5-2 0 10， Determination of Protein i n Foods(食品中蛋白质的测定). 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Bei j ing (北京)： Higher Education Press(高等教育出版社)，20 0 2： 300 ) ( 10 YU Ai-Min， WANG Zhen-De(于爱民，王 振 德). Ch i na Patent(中国专利)， ZL 2 00720003016.3 ) Fast Determination of Protein in Milk and DairyProducts Using Protein Fast Analyzer FENG Xu-Dong'， AN Wei-Dong， DING Yi， YU Ai-Min'， LIU Jing'， GAO De-Jiang’， WANG Zhi-Hong'， YU Yong’ (College of Chemistry， Jilin University， Changchun 130012) (Jilin Institute of Metrology， Changchun 130022) (Changchun Jilin University-Little Swan Instruments Co.， Ltd.， Changchun 130012) (College of Instrumentation & Electrical Engineering， Jilin University， Changchun 130012) Abstract A rapid analyzer for the determination of protein were developed. The effects of experimen-tal parameters， including temperature， time， and foreign substances were investigated. Several milkand dairy products were analyzed using the protein fast analyzer. The experimental results showedthat protein reagent can react with protein within 1 min at room temperature. The whole process ofprotein determination in dairy products only takes 5-10 min. The protein fast analyzer was applied tothe determination of protein in dairy products， the relative error is lower 5% compared to Kjeldahlmethod and standard amount method of protein in milk power. The relative standard deviation islower 1%.The determination results of protein were not affected by foreign substances， such asmelamine， urea， glycine， ammonium nitrate and so on. Keywords Protein fast analyzer； Milk and dairy products； Fast determination ( (Received 20 July 201 1 ； accepted 16 August 201 1 ) ) 数据