毛细管液相色谱柱中柱上筛板的原位热聚合制备检测方案(毛细管电泳仪)

分析测试学报FENXICESHIXUEBAO (Joumal of Instrumental Analysis)第27卷第1期2008年1月Vol.27 No.142~44 43马继平等：毛细管液相色谱柱的柱上筛板的原位热聚合制备第1期 毛细管液相色谱柱的柱上筛板的原位热聚合制备马继平，丁明玉”，朱华年，吕丽莉 (1. 青理理工大学 环境与市政工程学院，山东 青岛 266033；2.清华大学 化学系，北京 100084；3.兰州石化公司，甘肃 兰州 730060) 摘 要：利用有机聚合物的原位聚合反应，在0.32mm内径的弹性石英毛细管内制备了3mm长的柱上筛板，该筛板可以耐受至少40MPa的压力。将5 um C填料填充到带有筛板的毛细管内，制备了毛细管液相色谱柱，色谱分离结果令人满意。用该筛板制备的色谱柱结构最大程度地避免了柱后死体积的产生。 关键词：毛细管液相色谱柱；柱上筛板；整体柱；原位热聚合 中图分类号：0657.72 文献标识码：A 文章编号：1004-4957(2008)01-0042-04 Preparation ofOn-column Frit for Packed Cap illary HPLC Column byIn-situ Themopolymerized Porous Polymer MA Jiping， DINGM ing-yu'， ZHU Hua-nian， LULi-li (1. Institute of Envinonment &Municipal Engineering， Qingdao TechnologicalUniversity， Qingdao266033， China；2.Department of Chem istry， Tsinghua University， Beijing 100084， China；3. Lanzhou Petrochem ical Engineering Company， Lanzhou 730060， China) Abstract A 3 mm length of porous monolithic polymer was prepared in a fused-silica capillary of0.32 mm i.d by in-situ theimo-po lymerization method and used as on-column frit for a packed capil-lary HPLC column The on-column frit can resist high pressure up to 40 MPaPacking material of 5um was packed into the cap illary with the on-column frit by slurry method Atpressure driving mode，separation of samples was achieved using the capillary HPLC columnThe in-situ frit preparationmethod has the advantages of easy preparation， easy control of the location of the frit and m ild prepar-ing reaction condition Key wo rds： cap illary HPLC clumn； on-column frit monolithic columns；in-situ theimo-polymeri-zation 毛细管液相色谱与质谱联用技术已成为蛋白组学研究的重要工具1-31。目前蛋白组学研究中，主要采用颗粒填充毛细管液相色谱柱。该色谱柱主要由毛细管、固定相床层、筛板、柱尾、引出管(与检测器连接)等部分组成。与常规液相色谱柱不同，由于毛细管液相色谱柱的柱体积小，色谱系统内存在的死体积对柱效的影响很大，因此，柱尾与引出管连接处的设计非常关键，如设计不当将导致样品扩散，柱效降低。采用柱上筛板的结构可以有效地减少柱后死体积。目前报道的有关柱上筛板的制作包括硅胶填料烧结法[4-5]、硅胶柱上反应法：16、溶胶-凝胶(Sol-gel)法7-8. 本文介绍了一种新型毛细管液相色谱柱筛板制备方法。利用有机聚合物的原位聚合反应在弹性石英毛细管内制备了耐高压的柱上筛板，筛板的渗透性、稳定性及耐压性良好。由于筛板制作之前对毛细管内壁进行了预处理，使筛板与毛细管内壁间通过化学键结合在一起，因此即使毛细管柱的内径较大也不会在毛细管内壁与筛板间产生缝隙。本文将填料填充到带有筛板的毛细管内，制备了毛细管液相色谱柱，并考察了其对标准样品的分离性能。实验证明，该方法制备的筛板能够有效防止填料漏出，不影响色谱柱的分离性能。此外，该方法反应条件温和，制备过程易控制。 实验部分 1.1 仪器与试剂 Alltech 426 HPLC pump用于柱评价； Jasco Pu-980 Intelligent HPLC pump (Jasco， Japan)用于匀浆装 ( 收稿日期：2006-10-19；修回日期：2006-12-14 ) ( 第一作者：马继平(1972-)，女(满族)，河北南宫人，副教授，博士， Tel： 0532-8507 1 26 6 ， E-mail： ma j iping2001@yahoo. com. cn ) 柱；毛细管电泳紫外检测器，北京彩陆科学仪器有限公司；N2000色谱数据处理软件，浙江智达信息工程公司，浙江大学；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；0.32 mm i.d. ×0.45mm o. d. 弹性石英毛细管柱，河北省永年锐沣色谱器件有限公司； KYKY 2800扫描电镜，中国科学院北京科学仪器研制中心。 甲基丙烯酸丁酯(BMA)，二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)，美国 AcmosOrganics公司；丫甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷 (YMAPS)， 东京化成工业株式会社；偶氮二异丁腈(ABN)，天津福辰化学试剂厂，使用前重结晶除去杂质，75℃水浴加热条件下，ABN用乙醇溶解，趁热抽滤，冷却至室温，滤纸吸干，放入冰箱冷藏；正丙醇，，1，4丁二醇，北京市化学试剂三厂；甲醇，色谱纯，天津康德科技公司；三氯甲烷，分析纯，北京现代化学品有限公司；Cg填料，5um，日本Fuji产品；实验用水为重蒸去离子水。 .2 毛细管液相色谱系统的建立 与常规液相色谱系统相比，毛细管液相色谱系统要求更低的流量，系统内允许更小的死体积和更小进样体积的进样阀。为此，本实验采用毛细管电泳所用的柱上紫外检测器。另外，由于实验所用的泵最低可提供的流量为10uL/min， 因此需要分流。同时，将原有20uL的进样阀定量管换成1uL。图1为改造后的毛细管液相色谱系统的装置示意图。 1.3 筛板的制备 1.3.1 毛细管的预处理 对于毛细管液相色谱柱，在利用匀浆法将填料装入色谱柱的过程中需要很高的压力，因此制作的筛板必须能够耐压。实验在原位聚合筛板前先对毛细管内壁作预处理，引入双官能团试剂剂甲基丙烯酸氧氧基三甲氧基硅烷。具体步骤： ①利用水泵的负压将 0.1mol/L 氢氧化钠、水、丙酮 图1 毛细管液相色谱系统装置示意图 Fig.1 Schematic diagram of the cap illaryHPLC system 依次引入通过毛细管；；②通入氮气，吹干毛细管；；③将30%的Y甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷丙酮溶液充满经步骤②处理后的毛细管内，密封过夜；④用丙酮清洗毛细管，氮气吹干，备用。 1.3.2 筛板的原位聚合 将适量单体(BMA)、交联剂(EDMA)和致孔剂(正丙醇、1，4丁二醇和水)引入装有适量引发剂(ABN)的棕色小瓶中，超声5min，使混合均匀。向该整体聚合混合物中通氮气2min，以除去溶解在其中的氧气。将整体聚合混合物引入经双官能团试剂处战好的一段毛细管柱中(如40cm长)，控制合适长度(2~4mm)。待整体聚合物到达需要制作筛板的位置，立即用硅橡胶将毛细管两端封住，将其置于恒温水浴(60℃)中加热20h，取出毛细管，将其与高效液相色谱泵连接，用甲醇作流动相冲洗聚合筛板，以将未反应的残留物冲出。 1.4 毛细管液相色谱柱的制备 取0.2g5um C填料，用0.5mL三氯甲烷配制成匀浆液，超声混合均匀，装入匀浆罐中。匀浆罐与高压装柱泵相连，加压至40MPa，保持4h，逐渐降低流速，使柱压慢慢降为0，卸下装好填料的毛细管色谱柱。切去柱头一段未填充均匀的部分，使固定相实际长 20 cm。 2 结果与讨论 2.1 原位热聚合制备筛板的条件考察 好的筛板应具有良好的渗透性及一定的耐压性能。筛板的渗透性与孔隙率有关，孔隙率越大，渗透性越好。反应温度、聚合反应时间、聚合混合物中致孔剂所占的比例、交联剂和引发剂的用量等都会影响多孔整体材料的孔隙率及机械强度￥[10-11]。渗透性提高的同时，筛板的机械强度也会下降，所以应综合考虑，从而获得一个最佳的实验条件。将 BMA与 EDMA的质量比保持在59.5 ：39.5，加入质量分数为1%的ABN，致孔剂在聚合混合物中的质量分数为60%~70%，正丙醇在致孔剂混合物中的质量分数为30%~50%，60℃加热 20 h. 2.2 筛板的表征 采用如下配比：单体混合物 w(BMA)：：w (EDMA))：：w (A BN)=59.5 ：39.5 ：1，致孔剂混合物 w (正丙醇)：：w (1，4丁二醇))：：w(水)=50 ：40 ：10，聚合混合物中单体与致孔剂的体积比为40 ：60.在 0.32mm内径的石英毛细管中制作的筛板长3mm。结果表明，该筛板可以耐受至少40MPa的压力。在 10uL/min的流速下用甲醇冲洗该筛板，显示压力为0.26MPa， 说明筛板的渗透性良好。 图2为该整体筛板的扫描电镜照片，可以看到其表面多孔的结构。为了比较，采用烧结硅胶法制备了筛板，其扫描电镜图见图3.可以看出，烧结硅胶法制备的筛板孔径分布不均匀，并且毛细管外壁的聚酰亚胺涂层被破坏。 图2 整体筛板的扫描电镜照片 Fig.2SScanning electron micrograms ofthe frit made by in-situ polymerization 采用匀浆法在图2所示的形成筛板的石英毛细管内填充5um的C填料，制备了毛细管液相色谱柱，在筛板左侧紧接筛板处去掉弹性石英毛细管外壁的聚酰亚胺涂层 3~5mm，形成检测窗口以便柱上检测。为测试原位聚合筛板和匀浆填充固定相制备的毛细管液相色谱柱的可行性，利用制备的毛细管液相色谱柱分离了标准混合样品，色谱图见图4。结果表明，该色谱柱可以很好地分离样品。筛板可以承受色谱操作中的压力，没有填料漏出，并且性能稳定。在20MPa下，pH2~12范围内，采用甲醇、乙腈等有机溶剂至少可以连续运行48h。并且，色谱峰形没有严重的拖尾，说明制备的柱上筛板没有对样品造成强吸附的活性点。 3 结 论 本文采用有机物原位聚合法制备了毛细管液相色谱的柱上筛板，该筛板显示了很好的渗透性、机械强度和稳定性。利用柱上筛板，制备了毛细管柱，该色谱柱最大程度地避免了柱后死体积的产生，色谱分离结果令人满意。这种新型筛板制备方法具有反应条件温和、筛板 ( 孔径均匀、制备过程简单等优点。该方法同样适用于其他内径毛细管柱上筛板的制备。 ) 图3 烧结硅胶法制备的筛板扫描电镜照片 Fig. 3 Scanning electron microgramsof the frit made by sintering silicapacking material method 图4 7种化合物在带有原位聚合筛板的毛细管液相色谱柱上的分离谱图 Fig.4 Cap illary HPLC chrmatogram of sevencomponents on a reversed phase column with in-situ polymerization frit conditions： 20 cm X0.32 mm i.d.， 5um ODS X20 cm X0.32 mm i. d. column packed with ODS 5 umparticles； isocratic elution： methanol-water(75 ：25by volume)； flow rate： 3 uL /min； UV on-columndetection at254 nm； peaks： 1. thiourea， 2. benzene， ( 3 . toluene， 4. naphthalene， 5. biphenyl， 6. phenanthrene， 7. anthracene ) ( 参考文献： ) ( 陈令新，关亚风，马继平.微柱液相色谱的研究进展[J].化学进展，2003，15(2)：107-116. ) ( VISSERSJ. R e cent developments in microcolumn liquid chromatography[J ] . JChromatogr A， 1999， 856(1/2)： 117 -143. ) 变。 ( 参考文献： ) ( [1] 张蓉颖，庞代文，蔡汝秀.DNA与其靶向分子相互作用研究进展[J].高等学校化学学报，1999， 20(8)： ： 1 210-1217. ) ( [21 廖见培，刘国东，黄杉生.水溶性金属席夫碱与 DNA相互作用的荧光光谱[J]. 分析测试学报，2001，20(3)：5-8. ) ( [31 卢继新，张贵珠，黄志娜，等.巯嘌 呤 金属配合物与小牛胸腺 DNA的作用[J].化学学报，2002，60(6)： 967 -972 ) ( [4] 郭茂林，杨频，杨斌盛，等.以溴化乙锭为荧光探针研究二氯二茂钛与 DNA作用方式[J].I 科学通报，1995， 40(13)： 1187-1190. ) ( [5] 贺吉香，江崇球，高明霞.烟酸小檗碱与脱氧核糖核酸相互作用的研究[J].光谱学与光谱分析，2003，23(4)： 755-758. ) ( [6] 沈景山，孙丹丹，付连春，等.荧光光谱法研究抗癌药物与 DNA的相互作用[J].光谱学与光谱分析，2005， 25(2)： 2 32-234. ) ( [7] 卢继新，张贵珠，黄志娜，等. . 稀有金属甲氨蝶呤配合物与小牛胸腺 DNA相互作用的研究[J].稀有金属， 2003，27(6)： 7 47-751. ) ( [8] 彭俊峰，凌建亚，张晗星，等.虫草素与 DNA作用的光谱研究[J].光谱学与光谱分析，2004，24(7)：858- 861. ) ( 91 靳兰，杨频，李青山.荧光法研究手性金属配合物与 DNA的作用机理[J].高等学校化学学报，1996，17(9)： 1345-1348. ) ( [10] 林辉祥，毕琼斯，彭桦，等. . 钯铂抗癌配合物初步筛选的荧光法研究[J].高等学校化学学报，1992，13(4)： 443-446. ) (上接第44页) ( [3] YATERS J， ENGJ， MC O R MACK A. M ining genomes： correla ti ng tandem mass spectra ofmodified and un m odi f ied pep-tides to sequences i n nucleotide databases[J] . Anal Chem， 1995， 67 ： 3 2 02-321 0 . ) ( [4] ASA IE R， H U ANGX， FARNAN D， et al Si n tered octadecylsilica asmonolithic column packing in cap i llary electrochro- matography and micio high- perfommance liquid chromatography [ J] . J Chromatogr A， 1998， 8 06(2)：251. ) ( [5] LI S ， L L OYD K Dir e ct chiral separat i ons by cap illa r y electrop horesis using cap illaries packed with an al- aci d g l ycopro - tein chira l stationary phase [ J ]. Anal Chem， 1993， 65： 3684. ) ( [6] KNOX J， GRANTI Ele ct r ochromatography in pack e d tubes using 1. 5 to 5 0 um s ili c a gels an d ODS bon d ed silica gels[J ] . Chromatographia ， 1991 ， 32(7/8)： 3 17-32 8 . ) ( 71 SCHM D M， BAUML F ， KOHNEA， et al P reparation of on-column frits in packed fused sili c a cap illaries by Sol- Ge1 technology[J]. J High Resol Chromatogr， 1 999， 2 2： 4 38-442. ) ( [8] CHEN J， ZARER， PETE R S E， et al Sem ip reparative cap illary electrochromatography[J]. Anal C hem， 2 0 01， 7 3 ：198 7 -1992 ) ( [9] ER ICSON C ，LDJ， NAK A ZATO K， et al Preparation of continuous beds for electrochiomatography and reversed-phaseliquid chromatography of low molecularmass compounds[J]. J Chiomatogr. A ， 1997， 7 6 7(1/2)：33- 41 . ) ( 「101 SVEC F ， P E TERS E， SYK OR A D， et al Design o f the monolithic polymers used in cap i ll a ry electrochromatography columns[J]. J Chromatog r . A，2000，887(1/2)： 3 - 2 9. ) ( [111 ZOU H a nfa， HU A NG Xiaodong， YEM in g liang， et al M o nolit h ic stationa r y phases for liquid chroma t ography and cap illaryelectrochromatography[J ] . J Chiomatog r A ， 2002 ， 954(1/2)：5-32. ) O China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net