手工浓缩血小板中汇集滤白及深低温保存检测方案(离心机)

手工浓缩血小板的汇集滤白及深低温保存 郝俊海 （通辽市中心血站） 血小板输注是治疗各种因血小板减少或功能障碍引起出血的有效治疗手段。目前国内血小板制备多采用机采制备，由于机采无偿献血者的招募有一定难度并且随着临床血小板用量的逐年增加，很多地方的血小板供应单独靠机采已不能满足临床需求，而现有的血液资源大量被浪费，如何利用现有的血液资源分离手工浓缩血小板供应临床，同时尽量减少手工血小板多人份输注，容易引起同种免疫导致输注无效的弊端是解决目前血小板临床供应的一个有效途径。由于血小板免疫性输注无效主要为HLA抗体引起，其次为HPA 抗体[1，2]，去除手工浓缩血小板中的白细胞就可减少输血反应和最大限度地避免同种免疫的发生。本站采用血小板专用滤白滤器以每10u为一治疗量，制备新鲜汇集滤白血小板用于预防性血小板输注患者，同时制备冰冻汇集滤白血小板，用于急诊和手术止血患者，取得了较好的临床效果。现将方法报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料 200ml或400ml于6小时内采集22℃±2℃保存的三联袋全血；血小板专用汇集滤除白细胞输血器（南京双威生物医学科技有限公司提供）；二甲基亚砜（DMSO）上海博光生物科技有限公司提供。 1.2 仪器设备 Cyrofuge 6000i大容量离心机（德国贺利氏）；BC-2800全自动血液细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；SANYO MDF-U52V -86℃医用冰柜（日本三洋）；KJX-1A冰冻血浆解冻箱 （苏州市医用仪器厂）PC-100血小板保存箱（美国 HELMER）。 1.3 浓缩血小板的制备，采用富浆法制备。 1.3.1第一次离心，贺利氏 6000i离心机，22℃±2℃，加速度为 9，减速度为4， 200ml袋离心力465g，离心7min，400ml袋离心力1012g，离心8min。 1.3.2 注意 血袋装杯时不能打褶，防止离心后红细胞挂壁。最佳离心效果以离心后上层血浆中无肉眼可见红细胞，血浆与红细胞分层清楚并且无明显白膜层出现为标准，如果分层不清要混匀后适当加大离心机转速重离。分浆开始时可以不用控制流速，血浆分出一半后要逐渐减慢流速，以上层血浆分净且无红细胞混入为标准。 1.3.2 第二次离心 贺利氏 6000i离心机，22℃±2℃，加速度为 9，减速度为4，离心力3000g，离心10min。 1.3.3 血小板解聚 浓缩血小板1u留浆20-30ml，2u留浆30-50ml，分离后放置在血小板保存箱中（22℃±2℃）静置1h后，取出轻轻摇动血袋，频率60次/min，振幅5cm使血小板完全解聚后振荡保存（22℃±2℃）。 1.4 新鲜汇集滤白血小板制备 1.4.1汇集前 血小板保存24h内挑选检验结果合格，外观无肉眼可见红细胞并且呈云雾状，无细小颗粒，解聚完全的同型血小板，每10u为一个汇集量进行汇集。 1.4.2 汇集滤白 在百级净化间或净化台中采用无菌操作技术，将每袋血小板连接到血小板汇集滤器上，导入汇集袋中，然后把汇集袋挂在架上，打开滑轮，调解流速为点线状滤除白细胞。过滤完成把汇集滤白血小板袋热合。如果临床需要新鲜血小板就可直接发放，如需保存按下面方法制备。 1.5 冰冻汇集滤白血小板 1.5.1 低温保护剂准备 DMSO原液采用无菌技术加入静脉用生理盐水稀释成75%浓度，于-50℃冰冻柜中保存备用。 1.5.2 DMSO加入 制备完成的汇集滤白血小板袋称重，去皮，按7.1%的比例计算需加入的75%DMSO量，在百级净化间或净化台中采用无菌操作技术，用一次性注射器抽取-50℃75%DMSO快速加入血小板袋中，加入后轻轻摇动血袋，加入后血小板袋的手感温度应无明显变化。 1.5.3 冰冻保存 加入DMSO的汇集滤白血小板平放装入纸盒中，纸盒上面要开口，血小板袋的厚度不能超过0.5cm。将装盒后的血小板平放在-80℃的深低温冰箱中冰冻保存，要单层放置，不能叠放，放入后4小时内不能开启冰箱，防止在降温过程中温度回升，冰冻失败。 1.5.4 解冻 使用前把冰冻汇集滤白血小板从深低温冰箱中取出，套上塑料袋挂在37℃循环水解冻箱中20-40min解冻。 1.5.5 解冻后外观检查 解冻后的血小板外观应为淡黄色均匀混悬的液体，有旋光性，无絮状物和细丝为合格，可发放临床。 2 计数 随机抽检30袋（10u/每袋）汇集血小板，滤白前、滤白后和解冻后样品用全自动血液细胞分析仪进行计数结果（表1） 表1 30份样本WBC、RBC、PDW、PLT计数结果平均值、SD（n=30）及回收率计算 滤白前 滤白后 解冻后 残留白细胞WBC（109/袋） 0.116±0.046 0.002±0.006 残留红细胞RBC（1012/袋） 0.010±0.003 0.009±0.003 血小板平均分布宽度PDW 15.88±0.23 15.73±0.21 16.10±0.20 血小板计数PLT（1011/袋） 4.94±0.70 4.59±0.62 4.52 ±0.63 血小板回收率（%） 92.9 98.5 白细胞去除率（%） 98.3 3 讨论 3.1 滤白后每袋血小板残留白细胞计数均值为0.2×107个，远低于机采血小板标准[3]，平均去除率为98.3%，多数汇集袋达到100%；血小板计数均值为4.59×1011个，远高于一个治疗量的机采血小板标准[3]（2.5×1011）。平均回收率为92.9%，。 3.2 汇集袋中残留红细胞平均为9×109个，符合手工浓缩血小板标准，略高于机采标准[3]。 3.3 冰冻汇集血小板解冻后PDW均值为16.1，在正常范围（15-17）内，血小板的计数均值为4.52×1011，平均回收率为98.3%。 3.4 结果表明 每个治疗量（10u/每袋）手工血小板汇集后，采用血小板专用滤白滤器进行滤白效果良好，在提高治疗效果的同时减少了输血反应，最大限度地避免同种免疫的发生，也减轻了患者的经济负担，同时利用了现有的血液资源，缓解了血小板供需矛盾。 4科学合理输注 新鲜血小板保存期短，制备不及时，但输后计数提升效果优于冻冰血小板[4]，较适合需长期预防性血小板输注患者；冻冰血小板保存期长且冻冰血小板的临床止血效果优于新鲜血小板[4]，适用于血小板减少或功能障碍引起出血患者的止血，特别是假期、急诊以及创伤和外科手术出血患者的抢救。 参考文献 [1] Pamphlion DH，Farrell DH，Donaldson C，et al. Development of lymphocytoxin and platelet rective antibodies：a prospective study in patients with acute leukemia［J］.Vox Sang，1989，57：177-180. [2] 虞容，单筠，何吉，等. 血小板输注无效患者的血小板抗体分析. 上海医学检验杂志2003年第18卷第2期:111 [3] 中华人民共合国国家标准GB 18469-2001. 全血及成分血质量要求 [4] 于洋 刘景汉 低温保存血小板基础与应用研究进展. 中国输血杂志 2003年12月第16卷第6期：433 1 .