碳酸胍体系中5 一单磷酸核苷酸检测方案(毛细管电泳仪)

维普资讯 http：//www.cqvip.com分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry第9期1175~1178第32卷2004年9月 维普资讯http：//www.cqvip.com分析化学第32卷1176 碳酸胍体系中6种5'-单磷酸核苷酸的毛细管电泳分离研究 周文峰 袁倬斌* (中国科学技术大学研究生院应用化学研究所，北京100039) 摘 要 报告了在碳酸胍体系中研究6种5'-单磷酸核苷酸的分离工作，考察了分离条件对分离结果的影响。在最佳条件下，TMP、AMP、CMP、GMP、IMP、UMP等6.种核苷酸的线性范围分别为：5~350、2~300、10~40、5~350、10~400和10~400 mg/L；其检出限分别为：1、0.5、2、1、2和2mg/L。初步探讨了胍基与不同核苷酸之间的相互作用及这种作用对毛细管电泳分离的影响。并将实验结果与普通通酸盐体系作了比较。 关键词 胍基化合物，毛细管电泳，核苷酸 引 言 核苷酸是一类重要的生物物质，参与细胞的代谢。细胞是生命的最小单位。磷酸根是核苷酸中的基本组成部分。核苷酸的分析广泛应用于生物化学、药学及农业等领域中?-71，尤其在单细胞分析化学的研究中占有极重要的地位。 NH 胍基化合物是指含有基团 NH—C-NH， 的化合物或其衍生物。胍是最强的有机碱(pK=13.6)，在一般的生理环境中，它处于完全质子化状态，并且能在较大 pH 值范围内保持正电性。这种特殊的性质使得胍基易于在配基与受体及酶与底物间通过氢键或静电作用形成特殊的相互作用。胍基化合物对磷酸脂有着较高的亲和性，它与核苷酸之间的分子识别研究引起了关注。 迄今，在毛细管电泳对核苷酸的分离研研中，用 CE研究胍基基团与核苷酸间的作用，在胍基化合物体系中研究核苷酸的分离尚未见文献报道。考虑到碳酸胍是胍类化合物中简单且容易得到的一种，故选择在碳酸胍体系中研究6种5'-单磷酸核苷酸的分离，并考察了分离条件对分离结果的影响，初步探讨了胍基与不同核苷酸之间的相互作用对毛细管电泳分离的影响，并将实验结果与普通通酸盐体系做了比较。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 ACS2000型高效毛细管电泳仪(中科院研究生院应用化学所)；高压电源(0~30 kV)；S200 型紫外检测器(美国热电集团)；压差式进样；石英毛细管柱(河北永年光纤厂)，50 p.m i. d.，375 um o.d.，总长度60 cm，有效长度40 cm；pH-3C型酸度计(上海雷磁仪器厂)。核苷酸，生物试剂( Sigma 公司)；碳酸胍、NaOH、碳酸钠和碳酸氢钠均为分析纯(北京益利精细化学品有限公司)；盐酸，分析纯(北京化学试剂公司)；二次蒸馏水。 分离核苷酸及简称：鸟-5'-单磷酸二钠盐( guanosine-5'-monophosphate disodium salt，GMP)；肌苷-5'-单磷酸二钠盐(inosine-5'-monophosphate disidium salt hydrate，IMP)；胞苷-5'-单磷酸(cytidine-5'-mono-phosphoric acid hydrate，CMP)；胸腺嘧啶-5'-单磷酸(thymidine-5'-monophosphate，TMP)；尿嘧啶-5'-单磷酸( uridine-5'-monophosphate，UMP)；腺嘌呤-5'-单磷酸(adenosine-5'-monophosphate，AMP)。 2.2 样品准备 样品用缓冲溶液配制，微孔滤膜过滤，储存在冰箱中备用。 2.3 实验方法 ( 2003-09-10收稿；2004-02-06接受 ) ( 本文系国家自然科学基金(No.29875027，20175025)、分析化学重点基金(No.20235010)、电分析化学国家重点实验室基金及“十五” 科技攻关重大项目(No.2001BA210A04-7)资助项目 ) 实验前用0.1 mol/L NaOH冲洗毛细管5 min ，再分别用二次蒸馏水和缓冲溶液冲洗2 min。采用阳极端手动压差进样。每两次运行之间依次用0.1 mol/L NaOH、H，0、缓冲溶液冲洗2 min。缓冲溶液用1.0 mol/L NaOH、HCl调节至所需pH值。毛细管电泳工作条件为：检测波长254 nm；进样：位差10 cm，时间 10 s；数据记录采用 ACS2000软件；室温。 3 结果与讨论 3.1 pH 值对分离的影响 在pH值为8.5~10.0之间考察了pH值对6种化合物迁移时间的影响。胍基与核苷酸之间的相互作用主要是静电引力和氢键。研究110表表明：二者之间能形成相对稳定的分子间络合物，络合比一般是1：1；在水溶液中，二者配比为1：1时，用核磁滴定法研究了胍基与核苷酸之间的络合常数。研究表明，胍基与 AMP 和 CMP之间作用较强。AMP 与 CMP 的迁移时间随pH 值增大而减小。这是因为pH增大，核苷酸所带负电荷增加，络合作用加强，络合物整体所带负电荷减少，与电渗流相反方向的作用力减小，迁移时间减少。在普通碳酸盐体系中，AMP 与 CMP的迁移时间随pH 值变化与其它4种核苷酸一致。pH值9.5为最佳。 3.2碳酸胍浓度对分离的影响 在碳酸胍浓度为10~50 mmol/L情况下考察了6种核苷酸迁移时间的变化。实验表明，在18kV的分离电压下，所有核苷酸的迁移时间随缓冲溶液浓度增加而延长。与普通通酸盐体系相比，其中AMP和CMP的增加较为缓慢，这是因为二者容易和碳酸胍形成络合物。碳酸胍浓度为 20mmol/L为最佳缓冲溶液浓度。 图1 缓冲溶液 pH值对迁移时间的影响 图2 缓冲溶液浓度对迁移时间的影响 Fig. 1 Effect of buffer solution pH on migration time Fig.2 Effect of buffer solution concentration on migrationtime 分离条件( conditions)：缓冲溶液(buffer)：20 mmol/L碳酸胍(guanidine carbonate)；分离电压(separation voltage)：18 kV。 3.3 分离电压对分离的影响 分离条件(conditions)：缓冲溶液 pH 值(buffer pH)：9.5；分离电压(separation voltage)：18kV. 实验表明，在14~20 kV内，随着电压的升高，保留时间缩短，分离变差。与普通碳酸盐体系一致，分离电压为 18 kV 为最佳。 3.4 优化条件下6种核苷酸的电泳图 与无胍基的碳酸盐体系相比较，在分离条件相同时，碳酸胍体系中核苷酸整体出峰较慢，分离度变大，这可能是由于胍基的存在，改变了毛细管壁的结构，在一定程度上抑制了电渗流，并且对 AMP 和CMP 电泳行为影响较大。实验中曾试图用一种胍基修饰的β-环糊精作为改性剂来分离核苷酸，但是发生了电渗流反向的现象。 3.5 6种核苷酸的检出限及线性方程 6 种核苷酸的检出限及线性方程见表1。 图3 分离电压对迁移时间的影响 Fig.3 Effect of separation voltage on migration time 分离条件(conditions)：缓冲溶液( buffer)：20 mmol/L 碳酸胍(guanidine carbonate)；pH：9.5。 图4 优化条件下6种核苷酸的电泳图 Fig. 4. Electropherogram of the standard nucleotidesmixture 缓冲溶液(buffer)：1. 20 mmol/L 碳酸胍( guanidine carbonate)； 2. 20 mmol/L碳酸盐溶液(NazCO，-NaHCO；)；分离电压(sepa-ration voltage)：18 kV； pH：9.5；样品(samples)： a. TMP；b.AMP； c. CMP； d.GMP； e.IMP； f.UMP。 表1 6种核苷酸的工作曲线及检出限(n=5) Table 1 The working curves and detection limit of 6 nucleotides(n=5) 化合物 线性范围(mg/L) 工作曲线 相关系数(r) 检出限(mg/L) Compounds Liner range Working equation Correlation coefficient Detection Iimit TMP 5~350 y=3.069×10-x+0.4631 0.9980 AMP 2~300 y=2.574×10-4x +0.3735 0.9992 0.5 CMP 10~400 y=3.257×10-4x+0.5146 0.9985 2 GMP 5~350 y=3.107×10-x+0.4508 0.9993 1 IMP 10~400 y=3.301×10-x+0.5231 0.9989 2 UMP 10~400 y=3.319×10-4x+0.5208 0.9999 2 3.6 重现性实验 表26种核苷酸的的峰面积与迁移时间的重现性(n=5) Table 2The determiantion precision integrated peak area and migration time of 6 nucleotides(n=5) 化合物 Compounds 峰面积RSD(%) The RSD of 迁移时间 RSD(%) The RSD of 化合物 峰面积RSD(%) The RSD of 迁移时间 RSD(%) The RSD of integrated migration time Compounds integrated migration time peak area peak area TMP 3.14 2.18 GMP 3.22 2.69 AMP 2.80 2.32 IMP 3.43 2.74 CMP 3.35 2.53 UMP 3.50 2.98 综上所述，胍基化合物对核苷酸有分子识别作用，这种作用可用于毛细管电泳对核苷酸的分离中。在碳酸胍缓冲溶液中，6种5'-单磷酸核苷酸的毛细管区带电泳分离，具有体系简单、分离速度度、分离效果好、重现性好的特点。实验证明，该体系中6种核苷酸线性范围宽、线性关系好且灵敏度较高，可望用于细胞中相关核苷酸的测定。 ( References ) ( Wang Erkang(汪尔康). 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Chem.，2000， 65 ： 1697 ~ 1701 ) Capilary Electrophoresis Separation of Six 5'-MonophosphateNucleotides in Guanidine Carbonate Buffer Zhou Wenfeng，Yuan Zhuobin° (Institute ofApplied Chemistry，The Graduate School of the University of Science & Technology of China， Beijing 100039) AbstractsSix 5'-monophosphate nucleotides were separated by using guanidine carbonate as running electro-lyte. The effect of separation conditions was studied. The Linear range， regression equation and detection limitwere given. The linear range of six nucleotides was (mg/L)： thymidine-5'-monophosphate (TMP)：5~350；adenosine-5'-monophosphate (AMP)： 2~300； cytidine-5'-monophosphate (CMP)： 10~400； quanosine-5'-monophosphate disodium salts (GMP)： 5~350； inosine-5'-monophosphate disodium salt hydrate (IMP)：10~400； uridine-5'-monophosphate (UMP)： 10~400. The detection limit was (mg/L)： TMP： 1， AMP：0.5， CMP： 2， GMP： 1， IMP： 2； UMP： 2. A comparision was made between the guanidine carbonate andNa，CO，-NaHCO， as running electrolyte. Keywords Guanidine， capillary electrophoresis， nucleotides ( (Received 10 September 2003； accepted 6 February 2004) ) 《分析试验室》征订启事 国内统一刊号：CN11-2017/TF国际标准刊号：ISSN1000-0720国际 CODEN 码：FENSE4邮发代号：82-431国外代号：BM848广告经营许可可：京西工商商字第0038号 《分析试验室》是中文核心期刊，月刊，国内外公开发行。1982年创刊，目前已成为我国著名的分析化学专业刊物。影响遍及冶金、地质、石油化工、环保、药物、食品、农业、商品检验和海关等社会各行业及各学科领域。《分析试验室》以突出创新性和实用性为办刊宗旨，作者来自全国各行业的生产、科科第一线；被“CA”等国内外多家检索数据库、文摘收录，影响因子连续多年列化学类前列。本刊常设“研究报告”“研究简报”“仪器装置与设备”等栏目。“定期评述”栏目系统发布特邀知名专家学者撰写的国内外分析化学领域的综合技术，连续跟踪学术发展前沿。“国际会议”栏目每期介绍影响广泛的分析化学领域国际学术会议。2004年新设“特邀专家评论”，聚焦当前科研重点、难点热点。 《分析试验室》每期定价10元，全年12期，120元。 全国各地邮局征征，邮发代号82-431。漏订的读者可直接与编辑部联系。 编辑部地址：北京新街口外大街2号，邮编100088 电话：010-82013328，E-mail：analysislab@263. net