婴儿配方奶粉中左旋肉碱检测方案(离子色谱仪)

2 3Thermo Fisher Scientific，San Jose， CA USA is ISO Certified.ThermoSCIENTIFICPart of Thermo Fisher Scientific 陈军钟新林 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 Key words： L-Carnitine； Ion chromatography； Non-suppressor； Online-SPE 引言 左旋肉碱(L-Carnitine，β-羟基y-三甲铵丁酸)又称肉毒碱或维生素BT， 其化学式为C，H15O3N，分子量为162.2，是一种类氨基酸。L-肉碱作为载体将长链脂肪酸从腺粒体膜外输送到膜内，促进脂肪酸的β-氧化，从降低血清胆固醇及甘油三脂的含量，提高机体耐受力及减少代谢毒性作用。对婴幼儿来说，L-肉碱在维持婴幼儿生命及许多促进发育的生理过程，如生酮作用、蛋白质代谢等方面均有一定的功能。我国及许多其它国家已规定在婴幼儿食品配方中添加适量的L-肉碱，以满足其生理需要，更好地促进婴幼儿健康成长M-。 左旋肉碱极性较强，缺少发色基团，定量分析困难。国内外对左旋肉碱的测定主要有酶法ixi、电永KiixM、流动相注射串联质谱法网，高效液相色谱法xvi-xix等。酶法专属性强，但前处理繁琐，高效液相色谱法中低波长检测则干扰较多，衍生法灵敏度高，但前处理复杂，所用衍生剂毒性强。其它方法有的灵敏度较低。有的设备较贵等原因较少使用。 离子色谱法可测定在水溶液中能电离的物质。在酸性溶液中，左旋肉碱表现为阳离子特性，带正电荷，可用阳离子交换色谱柱分离。但左旋肉碱的两性特征使其在抑制后呈电中性，无法采用抑制型电导检测。同时，奶粉中左旋肉碱添加量较低，需要更低检出限的测定方法。为此，我们通过实验，摸索出左旋肉碱的在线固相萃取非抑制型离子色谱测定的新方法。该方法前处理简便、检测快速，用于奶粉样品中左旋肉碱的检测，结果令人满意。 测试条件 仪器： ICS系列离子色谱系统带双六通阀及双泵。 分析柱： lonPac CS17+lonPac CG17， 4mm 浓缩柱： lonPac TCC-UPL MSA： 0-20min，3mM；流速：1mL/min 柱温：30℃ 检测方式：抑制型电导检测 进样量：500pL 称取奶粉样品约1g至50mL比色皿中，加入超纯水14mL，适当摇晃，使奶粉充分溶解后加入21 mL乙腈 沉淀蛋白，静置10min，取上层清液， 10000r/min离心10min后，稀释5倍，将稀释液依次通过0.22pm尼龙滤膜和OnGuard II RP柱、Na柱，弃去6mL初始流出液后采集2mL样品用于离子色谱测定。 OnGuard II RP柱(规格2.5cc)，预先使用10mL甲醇和15mL水活化。 OnGuard IINa柱， 用10mL水活化。 结果与讨论 1.前处理条件的选择 奶粉配方比较复杂，含有大量蛋白质、糖和盐。如果奶粉中的蛋白质不经去除而直接进入色谱柱，则可能吸附在色谱柱上，导致色谱柱柱效降低甚至失效。沉淀蛋白质的常用方法有重金属盐沉淀法、酸沉淀法、有机溶剂沉淀法等。人为引入金属盐会导致去除成本升高，去除不干净可能导污染色谱柱而使色谱柱失效。如果采用酸沉淀法，会引入大量氢离子，对左旋肉碱出峰产生干扰。因此，这两种方法在本试验中均不考虑。采用加入乙腈沉淀蛋白的方法，沉淀蛋白效果较好，可得到澄清的上层溶液。通过在1g奶粉中加入1mL、2mL、5mL、10mL、14mL的高纯水来溶解奶粉，发现如果加入水的量过少，则奶粉溶解不充分，考虑到检出限的限制，我们用14mL高纯水来溶解1g奶粉样品。用乙腈来沉淀蛋白，乙腈的量是需要考虑的重要因素。在14mL的奶粉样品中加10mL、14mL、18mL、21mL、24mL的乙腈，发现如果乙腈的加入量小于水的量，则蛋白沉淀不完全，大量蛋白悬浮于溶液中，无法沉淀。随乙腈加入量加大，沉淀蛋白速度加快，上层液更加澄清。考虑成本因素，最终确定加入乙腈量为21mL。即可使蛋白沉淀完全，又不至于溶液中有太高比例的乙腈，导致浪费和后续处理困难。 稀释5倍的提取液依次通过RP柱和Na柱进行净化。用RP柱可除去疏水性的脂肪等物质， Na柱作为阳离子交换柱，，可除去钾、钙等阳离子，避免可能的干扰。 12.阀切换条件的确定 进样后，将阀切换到浓缩柱一边，用纯水将样品冲入浓缩柱，这时，残留的阳离子及左旋肉碱浓缩在柱上，乙腈被冲出。5分钟后，乙腈被冲洗干净。再将阀切换到分离柱侧，左旋肉碱在色谱柱上得到分离。比较了不同时间纯水的冲洗效果，5分钟比较合适，可将乙腈及其它无保留杂质冲洗干净。阀切换配置图如图1所示，切换程序见表1。 因为是非抑制电导检测，所以为了降低噪音，需要选择低淋洗强度淋洗液就能洗脱的离子交换柱。在戴安产品中符合要求的柱子有IonPac CS17、、lonPac CS18(6.0um， 250mm×2mm)、lonPac SCS1三种不同色谱柱。实验发现， lonPac SCS1柱亲水性差，左旋肉碱的峰形不好。lonPac CS17、lclIonPac CS18都是很低疏水性的柱，左旋肉碱的峰形对称性好。但实际样品测试的时候， lonPac CS18柱上左旋肉碱被不明峰干扰。因此，选择CS17+CG17作为分析L-左旋肉碱的色谱柱。 依次选用6、5、4、3、2mmol/L的甲基磺酸，测定奶粉中左旋肉碱的色谱分析特征，确定合适的淋洗液浓度。结果表明：随淋洗浓度从6mmol/L降低到2 mmol/L，背景电导从2231uS降低至777uS，噪声降低，理论塔板数提高，各成分间的分离度增大，峰形改善，信噪比从12增大至67.8，但保留时间也从6.91min增大至15.51 min。。综合考虑，我们选择3mmol/L的甲基磺酸作为分析用淋洗液。在优化的淋洗液浓度下，标准样品及真实样品的左旋肉碱色谱图如图2所示。 通过在前处理时加入钠柱，去除镁、钙、钾、铁、铜、锰、锌等阳离子，避免干扰左旋肉碱。干扰电导响应的乙腈，也已经在切换浓缩过程被纯水冲出浓缩柱，因此不会干扰左旋肉碱的检测。 图2.标准溶液及奶粉样品中左旋肉碱分离谱图 Fig 2 chromatograms of standard ( a， 0.5mg/L) and milkpowder sample (b) Column： lonPac CS17(6.5um，250mmx4mm)Eluent： 3mmol/L methanesulfonic acid Peak identification： 1. L-Carnitine 图1.奶粉中左旋肉碱测定阀切换配置图 Fig. 1 Configurations of valve-swithching in determination ofL-Carnitine of milk powder 表1.奶粉中左旋肉碱测定阀切换程序 Table1 Valve-switching procedures in determination of L-Carnitine of milk powder Time (min) Left Pump (for On-line SPE) Right Pump (for Separation) Valve Switching Flow Rate (mL/min) Eluent Flow Rate (mL/min) Eluent Left Right -7 1 water 1 methanesulfonic 6-1 6-1 acid (load sample) -5 2-1 6-1 0 6-1 2-1 20 6-1 6-1 按实验方法在选定的色谱条件下，对左旋肉碱进行线性和检出限测定。取标准工作液，以高纯水稀释成0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1mg/L，用离子色谱进行检测，以峰面积y对质量浓度x(mg/L)进行作图，得回归方程y=0.686x-0.006。线性范围17.5mg/Kg~175mg/Kg， 相关系数r>0.9995。取标准工作液，以高纯水稀释成0.01、0.02、0.03、0.04mg/L， 按优化条件进行处理后，以信噪比(S/N)≥3的最低浓度作为奶粉中左旋肉碱的检出限，测得左旋肉碱检出限为5mg/Kg。 7.精密度与回收率 按实验方法，取市售奶粉样品进行不同浓度加标试验，连续进样5次，测定左旋肉碱平均回收率和精密度，结果列于表2，该方法的回收率在92.3%~105.2%之间，RSD在1.4%~4.3%之间。 实际样品分析 按实验方法，惠氏膳儿加产品包装上左旋肉碱标示含量为7.7mg/100g、本文所测结果与之接近。惠氏爱儿乐和伊利奶粉包装上未标识添加有左旋肉碱，但本试验依然检出，这可能与天然奶源中就含有一定量左旋肉碱有关。 结论 采用阀切换-非抑制型离子色谱法来测定奶制品中的左旋肉碱，具有简单、快速、干扰少、环保等特点。相比常见的其它测试方法，避免了繁琐的前处理，无需衍生化，节约时间，重复性好，检出限能满足要求。该方法可用于奶粉中左旋肉碱的含量测定。 但本方法也有不足，即无法区分左旋肉碱和右旋肉碱，这是作者仍需继续研究的课题之一。 表2.方法的回收率与精密度(n=5) Table 2 Recoveries and precisions of the method(n=5) Analyte Milk brand Content ((mg/Kg) Spiked(mg/Kg) Recovery(%) RSD(%) L-Carnitine 20 96.3%~104.8% 3.3% Wyeth PE GOLD 85.9 50 98.7%~103.5% 2.3% 100 97.8%~101.7% 2.1% 98.8%~102.9% 2.4% Weyeth SMA GOLD 15.7 92.3%~95.5% 2.1% 100 97.7%~101.5% 1.4% 94.5%~105.2% 4.3% YiLi milk powder 55.1 96.1%~104.2% 3.2% 100 94.9%~99.5% 2.0% ( ZHANG H Y， ZHANG XJ， ZHANG H S. 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Please consult yourlocal sales representative for details. 上海 北京 免费服务热线：上海浦东新金桥路27号6号楼 北京东城区安定门东大街28号 8008105118邮编：201206 雍和大厦西楼F座7层702-715室 4006505118电话：021-68654588 邮编：100007传真：021-64457830 电话：010-84193588传真：010-88370548 ( GB14880-2009. National Standards of the People's Republic of China (食品营养强化剂使 用卫生标准，中华人民共和国国家标准). ) ( xi D avid C. W， Harvey E l， Gerald A. FoodChem，1997，59 (3)：325 ) ( [xii] Jose A. P， Fernando A， L u is A， P a blo S. Clin Biochem， 2006， 3 9： 1022 ) ( [xiii]VP，FK，RS， MV. J. Chromatogr A.2005，1081：60 ) ( [xiv ] C.M， N.V C.C， A.R， M.V. Anal Chimica A cta ， 1999，382：23 ) ( [xv] D avid W.J. Clin Biochem ，2010， 43： 1362 ) ( [xvi ] HUANG F， HUANG XL，WU HQ， et al. Chin J. Anal Lab (黄芳，黄晓兰，吴惠勤，等.分析试验室)， 2011，30(10)：111 ) ( [xvii ] Christopher J M， M ichael L， M a lina K S . ClinChimica Acta，2004，344：123 ) ( [xviii] Ke Li， Wei Li， YuFeng Huang. Clin Chimica Acta，2007，378： 159 ) ( xix] Paul E M， Stephen TI， Charles L H. Anal Chem， 2005，77：1448 )