食品中残留农药检测方案(液质联用仪)

SGCOE-16-05Excellence in science LC-MS/MS 快速检测食品中农药残留整体解决方案 序言 农药在农作物种植和生长过程中的使用十分广泛，然而残留在食物上的农药进入人体会对人体健康造成危害，因此各国对食品中农残的监测和允许的最大残留量都有严格的法规要求。特别是近年来，食品安全事故层出不穷，各国政府不断加强监管力度，对商品中的农药残留量要求越来越严格。面对大量的受管控农药和很低的允许残留量，开发高灵敏分析方法和更可靠更高效率的定性手段显得更为迫切。 通常，三重四极杆质谱仪检测食品中未知农药的定性方法是根据定性离子强度进行的，但是这种方法在某些特殊场合可靠性并不是很高，特别是对于低浓度的样品，可能产生假阴性的结果。因此使用扫描二级碎片离子的方法，通过产物离子扫描质谱图进行谱库检索，对未知物的筛选和定性确证的方法显得非常有意义。然而在 LC-MS/MS中没有现成通用的质谱库可以使用(一些用户自己的谱库除外，这些谱库通常是不共享的)。因此，建立 LC-MS/MS 方法检测食品中未知农药的谱库以及相应的快速定性定量方法成为一种需求。 本手册中，我们研究了507种化合物，优化了 MRM 分析参数及 LC 检测方法；并收录了300种农药的二级质谱图，客户可以在 MRM 同时得到产物离子扫描的质谱图，通过谱库匹配的方式进行定性，以加强数据的可靠性。为确保数据库的实用性，我们进一步对水果和蔬菜中的200种农药进行了研究，该方案包含LC-MS/MS 分离分析条件、MRM参数、校准曲线信息、方法检出限和定量限、仪器精密度及 MRM 触发产物离子扫描并进行谱库搜索进行定性等相关数据。 岛津公司作为全球著名的分析仪器厂商，进入中国已经近30年，自1875年创业以来，始终继承创始人岛津源藏的创业宗旨“以科学技术向社会做贡献”，不断钻研领先时代、满足社会需求的科学技术。长期以来，岛津公司一直关注国内外食品和药品安全，积极应对，及时提供全面、快速有效的整体解决方案。 目录 1..简介.. .1 2.实验方法... 2 3.农药信息和监测离子(部分). .4 4.MRM分析参数(部分) .6 5.标准品的色谱图(部分) .8 6.校准曲线及检出限(部分).. ..10 7.精密度实验... .14 8..回收率实验.. ..16 9.化合物信息及二级质谱图(部分). .18 10. MRM分析同时触发产物离子扫描实验. .28 附录：：化合物清单... 32 1.简介 本解决方案中我们研究了507种化合物，并收录了相关的二级质谱图和MRM分析参数等信息。利用LabSolutions软件对数据文件进行分析和处理，提取化合物的二级离子碎片，创建了二级质谱库，如图1所示。在该质谱库中化合物的各类信息(化合物结构、中文名称、英文名称、CAS号、化合物种类、分子量、分子式、碰撞能量CE等)一目了然。这样的一个质谱库为用户提供了极大便捷，用户可以根据目标化合物的二级质谱图进行质谱库的检索，依据谱库筛选出的化合物的质谱图匹配度对目标化合物进行定性，同时得到该化合物的各类信息。另外用户还可使用LabSolutions软件自行对质谱库进行扩展。 本解决方案在已建立的LC-MS/MS农药质谱库基础上，对水果和蔬菜中的200种农药进行了分析，考察了相关的LC分析条件、校准曲线、检出限、精密度以及MRM触发产物离子扫描实验，在MRM分析的同时可得到产物离子扫描结果。由岛津LC-MS/MS质谱仪具有超快的正负离子切换速度(5msec)，所以本数据集采用正负离子同时测定，一针进样得到正负离子模式下同时定性定量的结果。由于岛津LC-MS/MS质谱仪具有超快的扫描速度(30，000u/sec)， 因此在如此高通量(200种化合物，400个MRM通道)的检测同时可以有效地触发产物离子扫描，保证了定量的同时得到更加可靠的定性数据。通过得到的二级质谱图与农药质谱库进行搜索对比，，可快速定性，并同时得到目标化合物的结构式、分子量等信息。 图1. LabSolutions 质谱库窗口界面 2.实验方法 2.1样品信息和前处理 2.1.1标准品 将所有标准品配制成 0.5 mg/L的混合标准溶液，用于 MRM 参数的优化；用流动相逐级稀释到更小浓度，用于校准曲线的制作。 2.1.2样品前处理 方法一： 参考 GB/T 20769-2008，具体操作如下： 1).提取 准确称取20g试样于80 mL 离心管中，加入40 mL乙腈，用匀浆机匀浆提取 1 min， 加入5g氯化钠，再匀浆提取1 min， 在 3800 r/min 离心5 min， 取上清液 20mL (相当于10g试样量)，在40℃水浴中旋转浓缩至约1mL， 待净化。 2)净化 在 Sep-Pak Vac 柱中加入约 2 cm 高无水硫酸钠，并放入下接鸡心瓶的固定架上。加样前先用4 mL乙腈+甲苯(3+1)预洗柱，当液面到达硫酸钠的顶部时，迅速将样品浓缩液转移至净化柱上，并更换鸡心瓶接收。再用2 mL乙腈+甲苯(3+1)洗涤样液瓶三次，并将洗涤液并入柱中。在柱上加 50 mL 储液器，用25 mL 乙腈+甲苯(3+1)洗脱农药及相关化学品，合并于鸡心瓶中，并在40℃水浴中旋转浓缩至约 0.5 mL。将浓缩液置于氮气吹干仪上吹干，迅速加入1mL的乙腈+水(3+2)，混匀，混0.2 um 滤膜过滤后进行 LC-MS/MS 测定。 方法二：参照美国 AOAC 2007.01 QuEChERS 样品前处理方法： 使用岛津技迩 QuEChERS 产品进行样品前处理。具体为：取15g均质样品加入50 mL离心管中，加入 15 mL乙腈/甲酸(99/1，v/v)提取液，涡混后加入6g MgSO4 和 1.5g NaOAc，迅速进行振荡，然后离心 5 min (8000 rpm)。取上清液1mL，加入盛有150 mg MgSO4，50 mgPSA， 50 mg C18粉末的离心管中，涡混离心，上清液过滤膜后上机。 2.2分析条件 2.2.1仪器 实验数据的采集采用 LCMS-8040 液相色谱-三重四级杆质谱联用系统，具体配置为： 输液泵： LC-30AD×2 在线脱气机： DGU-20As 自动进样器： SIL-30AC 系统控制器： CBM-20A 柱温箱： CTO-30A 2.2.2液相条件： 色谱柱： Shim-pack XR-ODS Ⅲ 150 mm L.×2.0mm I.D.， 2.2 pm 流速： 0.4 mL/min 进样体积：5uL 柱温：40℃ 流动相： A： 2 mM 醋酸铵+0.02%甲酸水溶液； B：乙腈 洗脱方式：梯度洗脱，B泵起始比例为10%，时间程序如下： Time (min) Module Command Value 1 Pumps Pump B Conc. 10 4 Pumps Pump B Conc. 50 20 Pumps Pump B Conc. 75 22 Pumps Pump B Conc. 95 25 Pumps Pump B Conc. 95 26 Pumps Pump B Conc. 10 30 Controller Stop 2.2.3质谱条件 离子源： ESI 离子源接口电压： ESI+， +4.5kV；ESI-， -3.5kV 雾化气：氮气3.0 L/min 干燥气：氮气20 L/min 碰撞气：氩气 脱溶剂管温度：250℃ 加热模块温度：450℃ 3.农药信息和监测离子(部分) 4.MRM分析参数(部分) 表示定量离子 5.标准品的色谱图(部分) 50 ug/L 农药标准溶液的色谱图如下： (x100，000) .(x1，000) 270.10>148.20(+) ]270.10>133.10(+) 1 10.0 10.5 11.0 11.5 1. 乙酰甲胺磷 Acephate 3. 乙草胺 Acetochlor 4. 甲草胺 Alachlor 6. 涕灭威砜 Aldicarb-sulfone 7.涕灭威亚砜 aldicarb-sulfoxide 9. 莎磷 Anilofos (x100，000) 425.10>182.10(+) 1.5- 425.10>139.00(+) 1.0- 0.0- 5.5 6.0 6.5 7.0 10. 莠去津 Atrazine 12.四唑嘧磺隆Azimsulfuron (x10，000) 2.0-318.10>261.00(+) 1.5- 1.0- 0.5 0.0- 1.5010000967.100 1.25- 1.00- 0.75- 0.50- 925- 0.00- (x100，000)_ 3.0- 2.0- 10- 0.0 4.5 (x1.000) 359.10>156.00(+) 359.10>139.00(+) 5.0- 4.0- 3.0- 2.0- 1.0- 0.0- 8.5 2.00-360.00>316.10() 360.00>195.00(-) 1.75- 1.50 1.25- 1.00- 0.75- 0.50- 0.25- 0.00- 6.校准曲线及检出限(部分) 6.1校准曲线 根据各化合物的响应情况，将200种农药的混合标准溶液配制成浓度为 0.5~200 ug/L 的系列标准工作溶液，按2.2中分析条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，外标法绘制校准曲线，如下图所示。 4.0- 3.0- 2.0- 1.0- 0.0- 2.0- 1.5- 1.0- 0.5- 2.5- 2.0- 1.5- 0.0- 0.0- Area(x1，000，000) Area(x1，000，000) Area(x100，000)4.0-7.5-3.0-5.0-2.0-2.5.5-10-0.0- 0.0-0 50 100 150 Conc. 50 100 150 Cann 50 100 1501. 乙酰甲胺磷 Acephate 2. 啶虫脒 Acetamiprid 3. 乙草胺 AcetochlorArea(x1，000，000) Area(x100，000) Area(x100，000)4.0-7.5-3.0-5.0-2.0-1.0-2.5-0.0L0.0 0.0-150 100 150 Cons， 0 50 100 150 Conc， 50 100 1504.E甲草胺 Alachlor 5. 涕灭威 Aldicarb 6. 涕灭威砜 Aldicarb-sulfoneArea(x1，000，000) Area(x10，000，000) _Area(x1，000，000)1.00-7.5-0.75-5.0-0.50-2.5-0.25-0.00-10.0-50 100 150 Conc. 50 10 0 o1 50 Co nc . 50 100 1507.涕灭威亚砜 aldicarb-sulfoxide 8. 莠灭净 Ametryn 9. 莎稗磷 AnilofosArea(x1，000，000) Area(x1，000，000) Area(x1，000，000)2.0-5.0-1.5-1.0-2.5-1.0-0.5-0.0-0 0.0-50 100 150 Conc. 50 100 150 Cenc L 50 100 15010. 莠去津 Atrazine 11. 甲基吡恶磷 Azamethiphos 12. 四唑嘧磺隆 Azimsulfuron Sans. CanG 1.0- 0.5- Conc. 3.0 2.0- Conc. Area(x10，000) 2.5 13.2，4-二氯苯氧基-3，5，6-d3-乙酸 2，4-DD3 2，4-Dichlorophenoxyacetic Acid Area(x100，000) 19.二甲四氯 Chiptox 22. 麦草畏 DicambaArea(x100，000) 5.0- 25 0.0-1 50 100 150 Canr 25. 咯菌腈 Fludioxonil 26.氟虫脲 Flufenoxuron 27. 氟磺胺草醚 Fomesafen 6.2校准曲线参数及检出限信息 检出限的计算：对各化合物校准曲线最低点浓度进行分析，计算信噪比，以3倍信噪比算得仪器检出限；按2.1.2方法处理西红柿样品，得到基质空白溶液，对 0.1~5 ug/kg 的基质加标溶液进行分析，以10倍信噪比计算方法定量限。 所得曲线线性关系良好，部分化合物的线性方程、相关系数及检出限信息见下表。 7.精密度实验 对浓度为1、10和50 ug/L 的农药混合标准工作溶液连续测定6次，考察系统精密度，保留时间和峰面积的重复性结果如下表所示。结果显示，高中低3个浓度的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在 0.0%~0.44%和 0.1%~9.55%之间(其中绝大多数在5%以下)，系统精密度良好。三种浓度下部分化合物的保留时间和峰面积重复性结果见下表。 注：-表示化合物在该浓度下响应不能达到要求 8.回收率实验 为考察方法的准确度，采用加标0.1 ug/kg、1 ug/kg、5 ug/kg 的样品进行加标回收测定。分别准确称取 20 g 黄瓜、苹果及西红柿样品，然后分别加入2 pg、20 pg、100 pg 的混合农药标准品，相当于加标0.1 ug/kg、1 ug/kg、5 ug/kg， 按2.1.2方法进行前处理，得到样品溶液进行测定，回收率如下。 注：-表示化合物在该浓度下响应达不到要求 *表示基质中化合物浓度太高，无法计算回收率 9.. 1化合物信息及二级质谱图(部分) 1.涕灭威 英文名称： Aldicarb 结构式： CAS#：：116-06-3 分子式： C7H14N202S MW：：190.3 离子： [M+Na] m/z：213.1碰撞能(CE)：-16V 质谱图： 2.涕灭威砜 英文名称： Aldicarb-sulfone 结构式： CAS#： 1646-88-4 分子式： C-H14N204S MW： 222.3 .CH3 m/z： 245.1 碰撞能(CE)： -20V 质谱图： Inten.(x100，000) 3.莠灭净 英文名称： Ametryn 结构式： CAS#： 834-12-8 分子式：CgH17N5S MW： 227.3 离子： [M+H] m/z： 228.1碰撞能(CE)：-20V 质谱图： Inten.(x1，000，000) 4.莠去津 英文名称： Atrazine 结构式： CAS#： 分子式： CgH4ClN5 MW：215.7 离子： +m/z： 216.1 碰撞能(CE)：-20V 质谱图： 5.苯霜灵 英文名称： Benalaxyl 结构式： CAS#：71626-11-4 分子式： C20H23NO3 MW：.325.4 离子： [M+H] m/z： 326.2碰撞能(CE)： -14V 质谱图： 。 Inten.(x100，000) 6.苄嘧磺隆 英文名称： Bensulfuron methyl 结构式： CAS#：83055-99-6 分子式： C16H18N4O7S MW：410.4 离子： 、+m/z： 411.1 碰撞能(CE)：-17V 质谱图： 7.乙嘧酚磺酸酯 英文名称： Bupirimate结构式：CAS#： 41483-43-6H3C、JHCH3分子式： C13H24N403SHsCNMW：316.4O离子： [M+H]S.CH3m/z：317.1 碰撞能(CE)：-24V CH3 质谱图： 8.噻嗪酮 英文名称： Buprofezin 结构式： CAS#： 69327-76-0分子式： C16H23N3OSMW： 305.4离子： +m/z：306.1碰撞能(CE)： -14V 质谱图： Inten.(x1，000，000) 9.吡虫啉 英文名称： Imidacloprid 结构式： CAS#：：.105827-78-9 .0 分子式： CH10CIN502 H MW：255.7 离子： [M+H] =N m/z：256.1碰撞能(CE)： -14V -C| 质谱图： Inten.(x10，000) 10.硫线磷 英文名称： Cadusafos 结构式： CAS#： 95465-99-9 分子式： C10H23O2PS2 MW： 270.4 离子： m/z： 271.1碰撞能(CE)： -10V 质谱图： Inten.(x100.000) 11.仲丁威 英文名称： Fenobucarb 结构式： CAS#：：.3766-81-2 H3C-NH H3C， 分子式： C12H17NO2 MW： 207.3 CHs 离子： [M+H] m/z： 208.1碰撞能(CE)： -9V 质谱图： Inten.(x100，000) 12.3-羟基克百威 英文名称： Carbofuran-3-hydroxy 结构式： CAS#：16655-82-6 CH3 分子式： C12H15NO4 MW：237.3 离子：[M+H] m/z： 238.1 碰撞能(CE)：-9V 质谱图： Inten.(x10，000) 13.杀螟丹 英文名称： Cartap hydrochloride 结构式： CAS#：15263-52-2 NH- NH. 分子式： C-H16ClN302S2 MW： 273.8 S HCI 离子： [M+H] NHc CH m/z： 238.1碰撞能(CE)： -18V 质谱图： 14.氯嘧磺隆 英文名称： Chlorimuron-ethyl 结构式： CAS#： 90982-32-4 分子式： Ci5H15CIN40，S MW： 414.8 离子： + m/z： 415.1 碰撞能(CE)： -15V 质谱图： Inten.(x10，000) 15.矮壮素 英文名称： Chlormequat 结构式： CAS#：999-81-5 H3C 分子式： CsHi3ClN ：+CH CI MW： 158.1 CHs CI 离子： [M+H] m/z：1122.1碰撞能 (CE)： -26V 质谱图： 16.毒死蜱 英文名称： Chlorpyrifos 结构式： CAS#：2921-88-2 分子式： CgHuCl；NO3PS MW：350.5 m/z： 351.9 碰撞能(CE)：-16V 质谱图： Inten.(x10，000) 17.烯草酮 英文名称： Clethodim 结构式： CAS#：99129-21-2 分子式： C17H26CINO3S MW：：359.9 离子： [M+H] m/z： 360.2 碰撞能(CE)：-17V 质谱图： 18.乐果 英文名称： Dimethoate 结构式： CAS#：60-51-5分子式： C5H12NO3PS2 MW： 229.3 离子： +m/z： 230.0 碰撞能(CE)：-10V 质谱图： 19.灭线磷 英文名称： Ethoprophos 结构式： CAS#：13194-48-4 分子子： CgH19O2PS， MW：242.3 离子： [M+H] m/z：243.1碰撞能(CE)： -14V 质谱图： Inten.(x100，000) 20.咯菌腈 英文名称： Fludioxonil 结构式： CAS#：131341-86-1 分子式： C12H6F2N202 MW：248.2 离子：[M-H]- m/z： 247.1 碰撞能(CE)：35V 质谱图： Inten.(x10，000) 10.MRM 分析同时触发产物离子扫描实验 在MRM定量分析方法中，设置监测参数，当MRM 检测到一定强度的峰时，自动触发产物离子扫描，色谱峰对应的质谱图与我们已建立的质谱库进行搜索，搜索可得到匹配度、对应化合物质谱图及相关信息等，如下图所示，从而进行快速可靠的定性分析。本农药数据库收录的农药种类为300种现有国内热门农药，供相关人员参考。 9.1 MRM 触发产物离子扫描匹配度实验 本次实验分别对标准溶液和基质加标溶液进行分析，标准溶液为10、50、100 ug/L 的混合标准工作溶液，溶剂为甲醇。另外在经过提取净化后的苹果样品基基中分别添加10、50、100 ug/L 的标准溶液，即为基质加标溶液。 对这些溶液分别进行分析后，对相应的质谱图进行谱库搜索，匹配度结果如下： 注：-表示化合物该浓度下产物离子扫描灵敏度不够 在LC-MS/MS定性分析中，未知物谱图与库中化合物谱图的相似度是定性的重要依据，本次实验分别对一系列浓度的标准溶液和基质加标溶液进行 MRM 触发产物离子扫描测试，匹配度结果表明仪器的产物离子扫描功能可以产生稳定的离子碎片，受标准品浓度和基质影响较小。 9.2实际样品测试 称取 20.2411 g 苹果样品，按2.1.2进行处理然后测试。共检出9种农药，定量结果及产物离子扫描匹配度如下： No. 中文名称 英文名称 农药含量 (ug/kg) 扫描匹配度(%) 6 涕灭威砜 Aldicarb-sulfone 3.26 72 26 甲萘威 Carbaryl 2.54 91 27 多菌灵 Carbendazim 3.87 100 29 3-羟基克百威 Carbofuran-3-hydroxy 11.90 89 57 烯酰吗啉 Dimethomorph 0.19 67 92 异丙威 Isoprocarb 3.31 68 106 灭多威 Methomyl 4.95 99 109 速灭威 Metolcarb 4.02 82 135 霜霉威 Propamocarb 0.77 88 附录：化合物清单 485 吡氟禾草隆 Fluazifop-butyl 69806-50-4 C19H20F3NO4 383.36 ESI+ 486 伏草隆 Fluometuron 2164-17-2 C10HF3N2O 232.20 ESI+ 487 嘧苯胺磺隆 Orthosulfamuron 213464-77-8 C16H20N，O，S 424.44 ESI+ 488 甲基氟嘧磺隆 Primisulfuron-methyl 86209-51-0 C15H12F4N4O-S 468.34 ESI+ 489 啶虫丙醚 Pyridalyl 179101-81-6 C18H14C4F3NO3 491.12 ESI+ 490 嘧草硫醚 Pyrithiobac-sodium 123343-16-8 C13H10CIN2NaO4S 348.74 ESI+ 491 甲氧磺草胺 Pyroxsulam 422556-08-9 C14H13F3N6O，S 434.35 ESI+ 492 氟啶虫酰胺 Flonicamid 158062-67-0 CH，F3N30 229.16 ESI- 493 顺丁烯二酰肼 123-33-1 CHN202 112.09 ESI- 494 调环酸钙 Prohexadione calcium 127277-53-6 C20H22CaO1o 462.46 ESI- 495 灭螨醌 Acequinocyl 57960-19-7 C24H3204 384.51 APCI+ 496 羟基灭螨醌 Acequinocyl-Hydroxy 57960-31-3 C22H30O3 342.47 APCI+ 497 氧丰索磷 Fensulfothion-oxon 6552-21-2 CH17OsPS 292.3 ESI+ 498 乙基对氧磷 Paraoxon 311-45-5 C10H14NO，P 275.2 ESI+ 499 氰氟草酯 Cyhalofop-butyl 122008-85-9 C20H20FNO4 357.4 ESI+ 500 甲拌磷亚砜 Phorate Sulfoxide 2588-03-6 C-H170PS3 276.38 ESI+ JQA-0376 本公司三条工厂获得 ISO 认证 岛津企业管理(中国)有限公司/岛津(香港)有限公司 http：//www.shimadzu.com.cn 用户服务热线电话：800-8100439 400-6500439 样本中的试验数据除注明外为本公司的试验数据 岛津公司推出了 《LC-MS/MS快速筛查食品中的农药残留整体解决方案》。 该方案包含LC-MS/MS分离分析条件、MRM参数、校准曲线信息、方法检出限和定量限、仪器精密度及MRM触发产物离子扫描并使用谱库搜索进行定性等相关数据。岛津分析中心为客户提供了农药MRM定量检测的数据库，该数据库是专为中国登记农药（GB 2763-2014）、2015 版药典、农业部蔬菜产品质量安全风险评估监测项目、香港食物内除害剂残余规例等建立的应对中国规范的MRM数据库，共计507种化合物。