细胞中激光共聚焦实验的样品准备方法对比检测方案(细胞分析)

探讨流体剪切力对细胞活动的影响--流体剪切力对细胞吸收人造细胞器的影响 丹麦奥胡斯大学的纳米科学中心近日在SMALL杂志上发表了一篇关于纳米材料作为有细胞活性人造细胞器的文章。文章介绍了个有趣的现象：细胞在剪切力条件下培养的时候，会吸收更多的纳米颗粒，并且没有附加的细胞毒性。 文章中采用了内皮细胞和巨噬细胞做为实验细胞。将细胞培养在ibidi通道载玻片中，之后使用含有纳米颗粒的培养基，以一定的剪切力刺激细胞，细胞吸收的纳米颗粒的量比静置状态下有显著的升高。 分享一下这个实验的细节，或许大家可以从中找到自己研究领域的灵感。 一、实验准备实验材料及设备 1.细胞：内皮细胞、巨噬细胞 2.纳米颗粒： pPDA：在800nm直径的二氧化硅表面包被多聚多巴胺 (dopamine) pPEG： 在800nm直径的二氧化硅表面包被多聚乙二醇(ethylene glycol)pRGD： 在800nm直径的二氧化硅表面包被L-精氨酸、甘氨酸和L-天门冬氨酸的多聚物 (Arginylglycylaspartic acid ( RGD) is a tripeptidecomposed of L -arginine ， glycine， and L-aspartic acid) 3.培养耗材： ibidi六通道载玻片p-Slide VI0.4 Luer (ibidi， Germany， 80606)灌流管， 15cm， 1.6mm直径(ibidi， Germany，10962)串联管 (ibidi， Germany， 10830) 封口夹 4.仪器设备： ibidi流体剪切力系统，含空气泵 (ibidi， Germany， 10905)和流体单元(ibidi， Germany， 10903) 二.实验方法 在实验开始前一天，请将所有需要使用的试剂，培养基，通道载玻片，灌流管都在37℃的二氧化碳培养箱中放置过夜，排除由于温度差产生的微量气泡。 一)培养细胞 准备内皮细胞和巨噬细胞，按照常规细胞培养方法进行培养。最好使用比较健康的内皮细胞，以防在做流体实验时候细胞不能稳定贴壁。 按照下面流程铺细胞： 1.按每通道10000个巨噬细胞和40000个内皮细胞将细胞铺于通道载玻片的中，注意，将移液器头插入注液孔中再加入细胞悬液，i，可以轻微倾斜通道载玻片帮助细胞悬液充满整个通道。 2.盖上注液孔盖，将通道载玻片放入细胞培养箱中培养半小时，等待细胞贴壁。细胞贴壁后，拿出通道载玻片，在每个注液孔中分别加入60pl培养基，注意，枪头要悬在孔上方滴入培养基。 3.将通道载玻片再放入二氧化碳培养箱进行培养2-4小时左右，等到细胞刚刚长满为单细胞层，即可开始实验。注意，要使用单层细胞进行剪切力实验，使每个细胞均受到均匀的剪切力。 二.搭建流体系统 1.将灌流管按照说明放在置在流体单元上。在灌流管的储液管中加入含纳米颗粒的7.5ml培养基。这时不需要连接通道载玻片。实验前需要去除整个灌流管中的气泡，存留在灌流系统的气泡会影响剪切力的大小，有时还会使灌流系统中的液体流动停滞。 打开ibidi泵控制系统，在任务栏中找到“Remove air bubbles”， ibidi流体剪切力系统将自动运行下面任务，用于去除气泡。 (表一) 压力 剪切力 流速 持续时间 1) 50mbar None (no slide) 23.4ml/min 不限 2.连接通道载玻片。使用串联管，将通道串联起来。这样可以在同一个条件，同一种液体的刺激下培养不同的样本。 1) 2) 在细胞贴壁后，将串联管如如图示插入串联管 在每一个注液孔中加满培养基，要注意不能把气泡加入在注液孔中。 用1ml的无菌注射器吸满培养基，小心插入如图的孔中，不要引入气泡。 小心推入培养基，直到第一个串联管有培养基微微冒出。 10) 111) 小心的将串联管弯过来，插入相邻的注液孔中。不要产生气泡。 继续推动注射器，直到第二根串联管也被充满，继续推动注射器充满下一根串联管。 重复上面的操作，继续充满所有的通道和串联管。 将所有的串联管连接好后，将加满液体排除气泡的灌流管用封口夹夹住。 小心将灌流管的一个鲁尔接头从联通管中拔出，插入最后一个注液孔中。 小心将注射器移除，在注液孔中加满培养基，将灌流管的另一个接头插入。 串联灌流系统搭建完成。 三实验结果 如图所示，对于内皮细胞和巨噬细胞，在剪切力为T4=4 dyn/cm²时比静置条件ro吸收pRGD这种纳米材料有非常显著的升高。