酶标仪全新应用综述-Molecular Devices SpectraMax

细胞毒性检测 无限扩展>超乎你的想象 微孔板读板仪全新应用手册 内容 无标记细胞计数法.. .2 ScanLaterTM蛋白质免疫印迹检测技术. 3 心肌细胞跳动和细胞毒性检测 4 SpectraMax i3 Multi-mode Microplate Readerwith MiniMaxTM 300 Imaging Cytometer 细胞毒性检测 .5 标记物表达.. 6 细胞计数与细胞形态观察 7 细胞增殖/细胞毒性. 18 使用诱导多功能干细胞分化的细胞进行 细胞毒性试验.. 9 .使用SpectraMax@i3多功能微孔板平台检测内源性色氨酸含量.. .10 SpectraMax@ i3多功能检测平台兼容均 .相时间分辨荧光检测技术. .1 无标记细胞计数法 细胞成像实验往往都涉及荧光探针的使用，而这些探针有些会对细胞产生毒性或者只能作用于已经固定好的细胞。而通过无标记分析技术进行细胞计数和细胞汇合度检测的新方法，就能让研究者在定量检测细胞增殖和活力的同时，又无需担心因耗时的工作流程而导致细胞活力被破坏。SpectraMax@i3 多功能微孔板读板仪兼容强大的 MiniMaxTM 300成像操作平台，具有独一无二的无标记专利分析技术。可以使用户户不使用核酸染料(如DAPI，嵌入式结合DNA)或活细胞染料的情况下进行细胞增殖和细胞毒性等实验，避免这些染料对细胞产生一个长期的毒性作用。 无需荧光染料进行细胞计数和细胞汇合度分析 ( 无需影响细胞正常生长情况下进行细胞增殖的检测 ) 可在SoftMax@Pro软件界面上快速、简便地进行图像分析设置 通过实验表明无标记分析技术可以像经典的细胞核染色计数法和全细胞荧光染色计数法一样具有相同的精确度。使用无标记分析技术检测化合物处理后的细胞，得到的IC50曲线结果与荧光染料标记技术结果呈现出高度的一致性。 左图：软件提供全新的无标记分析模式，我们可以通过鼠标自定义圈选细胞，根据经验更好地区分出单个细胞(黄色)和非细胞区域(蓝色)。右图：紫色标记显示软件检测出的目的细胞 图1.使用SoftMax@ Pro软件对无标记细胞进行分析 cells seeded per well ScanLaterTM 蛋白质免疫印迹检测技术 _无需加入底物，可缩短检测时间 转膜蛋白抗体标记后信号稳定，数周内随时都可进行检测 可减低背景信号值且增加动态学检测范围 ·SsoftMax@Pro软件集成像与分析功能为一体 这里，我们推出了一种全新的基于SpectraMax@ i3和Paradigm@多功能微孔板检测平台的蛋白质免疫印迹检测技术——ScanLaterTMWestern Blot。该检测技术通过降低背景实现更宽的动态检测范围、并且实现长时间或多次重复扫描后仍然能够得到稳定的数据结果。此外，ScanLaterTM WB检测技术与化学发光方法相比，具有更加出色的灵敏度。 当用户使用ScanLaterTM Western Blot检测技术时可根据具体应用来优化其检测流程。二抗标记的销元素能在多功能微孔板读板仪Spectramax@i3和Paradigm@的TRF模块上实现低背景检测。图像结果均存储在 SoftMax@Pro的软件中，并能导出到Excel或Image J中进行分析。使用ScanLaterTM Western Blot检测技术进行蛋白质定量检测时，其动态学检测范围可以达到4个数量级且其线性检测范围也可达到3个数量级。此外，该信号的稳定性也并不会随着时间的推移或经多次扫描后而下降。 2488 1244 622 311 156 78 39 19 10 5 2 PgGST 图1：图为使用SpectraMax Paradigm Multi-Mode Detection Platform检测平台扫描的GST稀释浓度。 元素标记的另一个特点是信号稳定并对光漂白有抵抗性。数月后，信号稳定，仍然能够进行检测。 图2：第一天检测 图3：第57天检测，Eu标记信号依然稳定并对光漂白有抵抗性。 心肌细胞跳动和细胞毒性检测 将化合物诱导心肌细胞跳动频率变化的结果与细胞活力分析结果结合起来，可以帮助用户更加精确评价心肌细胞毒性的结果。我们在观察由化合物诱导产生的跳动频率的变化或异常节律的同时，往往都可以与细胞活力实验相结合。使用SpectraMax@ i3微孔板读板仪和若干种已知化得沈依超刑的检：合物进行心肌细胞跳动频率的检测实验，获得浓度依赖型的检测结果。在同一孔中可利用MinMax@成像系统分析心肌细胞毒性，结合心肌细胞跳动频率的结果，一次检测可获得更多数据，例如可在同一孔中可进行钙流和细胞活力的分析，可以相互佐证化合物对心肌细胞跳动和细胞毒性的影响情况。 通过一台仪器即可观察心肌细胞跳动的频率，也可通过荧光成像来检/测细胞活力 分析化合物对细胞产生的不同影响 ( SoftMax@Pro软件提供了简便的模板设置方式，无需用户具有专业的成像分析经验 ) 本实验中，我们使用Molecular Devices公司的Early ToxTM心肌细胞毒性检测试剂盒和Spectramax@i3多功能微孔板读板仪来研究化合物对心肌细胞的影响。特别感谢Cellular Dynamics公司提供PSC心肌细胞。 图中结合了峰值与细胞活力检测的结果：通过动力学追踪和成像两种方法详尽阐述了四种化合物DMSO (control)、Digoxin、Haloperidol 和Staurosporine对细胞的影响。Digoxin和Halo-peridol 会降低心肌细胞跳动的峰值数，但不会显著影响细胞活力，但Staurosporine对两者都会有比较显著地影响。 通过结合荧光成像和化学发光法检测，更加全面、完整地评估出细胞活力 明视场成像可提供细胞形态学信息，易于质量控制 细胞凋亡无论是在胚胎发育、癌症或神经退行性等疾病中都是一个很重要的过程。分析细胞凋亡和细胞活力的情况可以为揭示细胞死亡机制提供更多的重要信息。通常情况下普通微孔板读板仪可提供整孔细胞的化学发光信号值或荧光信号值，但实际上我们如果将上述上还分分析结果与细胞成像结果整合在一起后，就能收集到更多、更完整的信息。Spectramax@i3微孔板检测平台允许用户逐孔或逐细胞的来检测细胞凋亡和细胞活力的情况，也可以通过监测细胞形态来进行质控检测。 SoftMax@Pro软件集成像和分析功能为一体 图1：Hela细胞中荧光检测caspase活性 上排：左边是检测在Anisomycin刺激下细胞释放Caspase后的结果，右边为未加入刺激物的对照组，凋亡细胞会发出绿色荧光信号。 下排：明视场成像Anisomycin刺激(左图)和未刺激(右图)的细胞， Anisomycin刺激下的凋亡细胞的分布与凋亡荧光信号位置一致，所有图片均获取自SpectraMax@i3多功能微孔板读板仪的MiniMaxTM 300 成像系统。 图2：标准化caspase活性和细胞活力数据 [Anisomycin](um) Anisomycin 刺激下 Hela细胞的 Caspase(绿色)和 ATP(蓝色)检测的结果。Caspase 活性结果获取自 SpectraMax i3 MiniMax 成像系统， ATP 活性结果由SpectraMax i3多功能检测平台的化学发光模式下获得。 标记物表达 细胞内某种蛋白的存在与否可作为一种刺激反应、一种分化状态、一类细胞的独有特征或判断基因转染实验效率的标记物。例如，血管表面表达的血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)，通常不存在于正常的血管内皮细胞中，但可以在 TNF-α刺激诱发炎症反应。细胞中此类蛋白的表达人时情况可以通过成像系统分析结果且进情虎可行定量。首先将人脐带血管内皮细 )付八巾胞用抗炎症化合物进行预处理，然后与相应的细胞炎症因子一起孵育。这里我们使用 SpectraMax@ i3多功能微孔板读板仪的MiniMaxTM成像系统，向大家展示了抗炎化合物如何对炎症因子刺激产生蛋白表达情况的影响。 轻松检测每孔或每个细胞中标记物的表达水平 可检测细胞中表达目的标记物的荧光面积 ( SoftMax@Pro软体可直接给出浓度效应学曲线并计算出 IC50 值 ) 通过总荧光量检测刺激后表达蛋白。 Effect of anti-inflammatory compounds on protein expression 上图： 炎症因子刺激下细胞VCAM 蛋白表达。 右图：粘附分子在抗炎症化合物的作用下总表达量(蓝色-SB202190；红色-SB203580). 细胞计数与形态学观察 使用微孔板读板仪对细胞形态进行/观察 读板前可对移液不精确或细胞生长不均等误差对实验结果产生的影响做质控 我们通常利用台式微孔板读板仪的化学发光或荧光检测模式来检测细胞的ATP或刮细胞荧光信号强度，可以间接的计算出细胞的数目。虽然这些检测方法能够得到可接受的近似细胞数，但它们不能提供可视化的图像信息，如生长状态的均一性、移液的精确性、细胞大小或其形态是否发生改变等。此外，如“偶发事件”或可检测细胞数目非常少的情况下，基于传统方法的检测精度远不如成像模式下所获得的结果更加的精确。 基于成像的实验可达到每孔一个细胞的检测下限 因此，如选择SpectraMax@ i3并兼容 MiniMaxTM成像系统的多功能微孔板读板仪就是可以补充细胞学的统计结果，能够提高基于细胞学试验结果的准确度。SpectraMax@i3多功能微孔板读板仪的MiniMaxTM 300成像系统比普通微孔板读板仪检测系统的灵敏度要高出100倍左右，并可以达到一个细胞每孔的检测下限。 左边：通过4个视野来成像96孔板中一个孔内的单一GFP阳性细胞的结果。右边：在4个视野中可以精确地区分出14000个荧光微球。 左边：荧光法标记悬浮细胞(RBL-1 leukemia cells)核的结果。图上的紫色标记用于显示通过成像系统鉴定和检测到的细胞。右边：用同样的方法对贴壁细胞(NIH-3T3 fibroblasts)进行成像和区分，通过MiniMax成像系统可以精确地检测出形态不一致的细胞。 悬浮细胞和贴壁细胞荧光信号值检测的动态学范围可以达到4个数量级，线性方式拟合后R2>0.96。 用已知化合物刺激肝细胞诱发肝毒性。增殖/毒性的结果可通过测定总细胞面积来进行评估。在这里，我们向大家展示如何应用SpectraMax@i3多功能微孔板读板仪和配有MiniMaxTM成像系统的仪器来完成细胞增殖和细胞毒性的检测。 在 96 或 384 孔板中通过细胞在孔内覆盖面积的比率来进行毒性筛选实验 细胞可视化 扣提供有关细胞毒性的更多信息 Aflatoxin 1 Aflatoxin 4 Staurosporine Mitomycin C 图1：肝毒性实验热图(Heat map)表明不同浓度的四种化合物对细胞的影响。 (蓝——细胞数少；红-——细胞数多) Dose-response curves of hepatotoxic compounds 使用诱导多功能干细胞分化的细胞进行细胞毒性试验 虽然应用化学发光法或荧光法在微孔板读板仪上检测细胞毒性的标准流程已经众所周知，但我们可以通过细胞成像系统获得更多更有用的信息。细胞活力检测染料，如钙黄绿素AM，它可用来标记活细胞数目来反映出化合物对细胞的毒性作用效果。钙黄绿素AM只有进入活细胞中才会表现出功能性酯酶活性，从而发出绿色荧光。我们先将iPSC分化的人源肝细胞先用各种化合物孵育24小时后，然后用黄绿素AM标记活细胞。最后使用SpectraMax@ i3多功能微孔板读板仪的MiniMaxTM成像系统对活细胞进行成像分析。 图1和图2：使用SoftMax@ Pro Software的细胞增殖模块识别活细胞中细胞质区域(绿色部分)。 图2. 图1. 图3：使用软件曲线拟合功能计算出IC50。 使用SpectraMax@i3多功能微孔板平台检测内源性色氨酸含量 在此应用中我们展示出如何利用SpectraMax@ i3多功能微孔板读板仪来检测内源性色氨酸的荧光强度。通过图中色氨酸的标准曲线可以看出SpectraMax@ i3具有很高的检测灵敏度，溶菌酶变性后发现其发射峰的位置发生了移动，溶菌酶中含有的两种色氨酸残基在紫外光照射下会发出荧光信号。当溶菌酶被变性后，通常色氨酸的发射峰的位置会移动6-10nm， 通过对天然和变性后的溶菌酶进行荧光光谱扫描后发现其发射峰的位置发生了移动。SpectraMax@i3多功能微孔板读板仪通过检测内源性氨基酸荧光强度来鉴定蛋白质。带宽可调型光栅单色器使得色氨酸检测的灵敏度下限可以达到6nM，且在蛋白质变性后可以精确的测定出荧光发射峰的位置变化。通过SoftMax@Pro软件预设模版，可自动计算出其发射峰值和发射峰位移变化的情况，节省了分析的时间。 图一：用PBS缓冲液梯度稀释色氨酸生成的标准曲线，线性灵敏度检测下限可以达到6nM [L-tryptophan](nM) 图二：分别对天然溶菌酶和变性后的溶菌酶进行光谱扫描后，发现其发射峰位置从351nm移动到了361nm，且变性后其荧光强度有所增加，变性后的溶菌酶发射峰位移。发射峰光谱扫描天然溶菌酶(红色)和变性后的溶菌酶(蓝色)，发现峰值移动10nm。 Emission wawoleogm tex 270 nM) SpectraMax@i3多功能检测平台兼容均相时间分辨荧光检测技术 Laurence， Monnet1， Cathy Olsen1， and Marie-Laure Lebreton2 1Molecular Devices， LLC， 1311 Orleans Drive， Sunnyvale， CA 94089 USA2Cisbio Bioassays， Bagnols-sur-C eze Cedex， France 众所周知HTRF检测技术对检测条件有着特殊的要求，通过时间分辨荧光检测两种不同的波长可以弥补由于化合物互相干扰、样品荧光淬灭以及降低检测过程中背景荧光信号的干扰。HTRF检测技术对读板仪的光路系统、光源能量的强度和检测器都有很高的要求。仪器设置也会对检测效率产生很大的影响。CisBio公司严格的认证过程确保每一台印有其认证标志的读板仪能够输出最佳检测结果。 图表一：HTRF质控试剂盒分别使用黑色和白色微孔板检测后的结果，可以看出所有检测数值均超过了厂家认证要求。 Low callbrator High calibrator 图表二： SpectraMax@ i3多功能微孔板检测平台的设置可用于HTRF试验Eu元素或者Tb元素作为供体分子检测方式，红色受体分子的检测。 TNF-αAssay 图1：TNF检测标准低于传统典型标准曲线范围，SpectraMax@ i3检测平台能够检测到低于最低浓度标准品的样品，计算后检测灵敏度的下限可达达5pM。 IcAMP]inM 图2：分别在白色384孔板(红色曲线)或者黑色384孔板(绿色曲线)中检测后拟合出cAMP HiRange标准曲线，动态学范围>2900(%Delta F)， EC50值分别为7.4nM和9.5nM， 结果的EC50<25nM， 完全与已发布产品信息一致。 图3：分别在白色384孔板(红色曲线)或者黑色384孔板(绿色曲线)中检测后拟合出Ip-One Tb的标准曲线，EC50值取决于检测试验中IP1的最终浓度，白色板中为137nM而黑色板中为158nM，与已知的产品信息一致。 公司简介 Molecular Devices始创于上世纪80年代美国硅谷，作为全球高通量仪器设备的领导者，一直致力于为生命科学研究及药物研发提供最先进的全方位解决方案。其产品覆盖微孔板检测分析、高通量筛选、高内涵成像、高效克隆筛选等。公司以持续创新、快速高效、一流质量的产品及完善的售后服务著称业内。 Molecular Devices为您提供高性能的分析检测系统，加快和改进药物研发及基础生命科学的研究。我们的产品几乎可以满足所有通量、内涵以及预算的需求。除了科研单位和部门外，我们还帮助制药和生物技术企业从分子、细胞和系统水平去了解各项生物功能，研究开发新的治疗方法。 Molecular Devices于近几年收购了Universal Imaging Corporation(2002年)、Axon Instruments(2004年)、Blueshift Technologies(2008年)和Genetix(2011年)，从而进一步拓展了公司的产品领域。现在，Molecular Devices与Leica、AB Sciex、Beckman Coulter等公司均隶属于Danaher集团公司，我们的产品线包括：微孔板读板机系列、液体处理系统、电生理检测系统、神经细胞生物学仪器和软件、高内涵细胞成像系统、生物芯片扫描仪和软件、克隆挑选系统、Threshold系统以及筛选试剂等。其中，微孔板读板机系列涵盖了光吸收、荧光强度、化学发光、荧光偏振、时间偏振荧光等测读模式以及终点检测、光谱扫描、快速和慢速动力学的检测方法。 Molecular Devices总部位于美国硅谷中心桑尼韦尔市，并在全球设有多个代表处和子公司，包括美国、法国、英国、德国、中国、韩国、日本、巴西等。2005年， Molecular Devices在上海设立了第一个中国代表处，2012年Molecular Devices在国内正式成立商务公司：美谷分子仪器(上海)有限公司。