顶空进样进行静态顶空血醇分析

实验部分 线性 用G1888网络化顶空进样器进行静态顶空血醇分析 作者 前言 Roger L. Firor and Chin-Kai Meng Agilent Technologies， Inc. 2850 Centerville Road 在法医分析实验室血醇分析是一种广泛使用、高通量的应用技术，使用静态顶空进样测定各种不理想基体中的挥发物有着尽人皆知的优点，血液和生物体液肯定是不干净的基体，所以非常适合用顶空进样。根据GC分析，自动顶空进样包括简化进样和色谱柱的维护、定量性能更好、样品制备工作很少、并且增加了分析通量。G1888网络化顶空进样器使用完全惰性的流路、均匀的加热区域以及特有的放空管线吹扫功能，把这些功能综合在一起，它会减少交叉污染，提高重复性。 双柱系统具有某些优点，使乙醇的洗脱次序和一些代谢物在DB-ALC1和DB-ALC2固定相上是不同的，这样就增加了确认的功能，同时大大减少了可能的干扰物或与乙醇一起的共流出物的影响。参见表1，列出仪器的设定值。 表1..仪器的条件 保护柱 0.15m×0.53mm去活的熔融硅胶 去活的Y型分流管安捷伦部件号5181-3398 0.32 mm色谱柱系统的 6890N GC 进样口 分流/不分流 温度 150°C 分流比 载气 进样口压力 18.8 psi 检测器 FID， 300°℃ GC柱箱程序 起始温度 35°C 起始时间 7 min G1888A顶空进样器 定量管容积 1mL 样品瓶压力 11.5 psig(由GC EPC辅助提供) 顶空箱温度 60°C 定量管温度 70°℃ 转移管温度 80°C 平衡时间 15min，强烈摇振 GC分析周期 6 min 加压 0.15 min 放空(填充定量管) 0.15 min 进样 0.5 min 色谱柱 DB-ALC1 30m×0.32 mm×1.8 pm DB-ALC2 30 m×0.32 mm×1.2 pm 双孔密封垫圈安捷伦部件号5062-3580 两支色谱柱连接到一个分流/不分流进样端口上形成两个系统，这样可以把样品同时注入到两支色谱柱中，每个色谱柱都与一个火焰离子化检测器(FID)相连，使用一个Y型连接管/保留间隙管和双孔密封垫圈分别连接到0.53 mm和0.32mm系统上。在连接好之后使用正丙醇进行初始化试验，保证在两支色谱柱之间分流要相等，记录的峰面积在两个通道的一致性在5%以内。 在进样口多路连接附近切断载气，把G1888顶空进样器连接到分流/不分流进样口上，然后用一个零死体积连接管(ZDV)把顶空转移管在多路连接块上和进样口载气相连接。截断的载气管连接气源的一端连接到G1888顶空进样器后面的电子压力控制(EPC)载气进口隔板上。因此，从6890N进样口EPC通道可用于载气流速的控制。 从头到尾使用10 mL顶空样品瓶，每一个瓶装2mL水溶液。向10 mL顶空样品瓶中加100 uL 0.1 g/dL制备标准样，用作分离度的检查。 结果和讨论 在这一应用报告中，使用G1888顶空自动进样器，这一进样器的Siltek TM样品通道具有极强的惰性和最小的交叉污染作用。样品通道管、进样针、转移管和放 空管全都进行了去活处理。很小心地处理了冷却点，以便降低不希望出现的冷凝作用。开始建立血醇系统，首先检查样品在两支色谱柱之间分流均匀，用以确认色谱柱安装合适，然后检查分离度。为了要检查分离度和峰的对称性，使用八组分样品(Restek #36256)得到的结果如图1所示。在美国一般使用正丙醇或异丙醇作内标(ISTD)进行GC的血醇测定，但是在尸体检查工作中，，-一般使用甲乙酮(MEK)，因为正丙醇会有降解产物。 图1.用分离度检查标样， 在0.32mm色谱柱系统上在35℃下的色谱图 峰识别：1.乙醛，2.甲醇，3.乙醇，4.丙酮，5.异丙醇，6.正丙醇， 7.乙酸乙酯，8.1甲乙酮 使用大口径色谱柱系统分离六组分混合物的色谱如图2所示。 6 图2.使用0.53 mm DB-ALC1和DB-ALC2色谱柱及六组分标样在35°C下得到的色谱图 峰识别：1.乙醛，2.甲醇，3.乙醇，4.丙酮，5.异丙醇，6.正丙醇 重现性 用八组分标样在0.32双柱和0.53双柱系统上测定的重现性分别列于表2和表3中。 表2. 在0.32mm色谱柱系统上的重现性(RSD)：18次分析，每次分析使用含有0.1 g/dL和0.15 g/dL的校准溶液。对DB-ALC1(0.15 g/dL的分析)最大k为0.291，而最小值为0.285 浓度 (RSD) DB-ACL- g/dL 乙醛 甲醇 乙醇 丙酮 异丙醇 正丙醇 甲乙酮 校正因子k 0.1 0.78 2.32 2.11 1.12 1.75 1.83 0.82 0.36 0.1 0.72 2.77 2.10 1.72 1.72 1.85 0.95 0.34 0.15 0.86 3.11 2.68 1.31 2.34 2.50 0.93 0.58 0.15 0.84 3.48 2.69 1.33 2.31 2.50 0.93 0.55 表3. 在0.53mm色谱柱系统上的重现性(RSD)：0.1%溶液的40次分析 DB-ALC- 乙醇 丙酮 异丙醇 乙腈 正丙醇 乙酯 甲乙酮 1.12 0.95 0.94 0.95 0.96 2.34 2.00 2 1.22 0.99 1.01 0.96 0.90 0.83 0.93 1.70 1.13 许多实验室使用一系列0.15 g/dL乙醇浓度的复制样品对系统性能进行校准和评估，图3A和图3B是使用DB-ALC1和DB-ALC2色谱柱测试这一混合物的色谱图。 6 图3.在 0.32 mm DB-ALC1(图3A)和DB-ALC2(图3B)色谱柱上分析0.15 g/dL血醇标样峰识别：1.乙醛，2.甲醇，3.乙醇，4.丙酮，5.异丙醇， 6.n-丙醇，7.甲乙酮 交叉污染 在血醇分析中负样或空白样品中乙醇交叉污染量应该小于1.0%，使用每一组分为0.5%的样品来验证有没有交叉污染作用，如表4所示。这一乙醇浓度几倍于预期的数值，是有代表性的对交叉污染的严格测试，应当说明系统没有明显的问题。在0.15 g/dL浓度的标样进行18次分析以后，当使用水/内标进行乙醇的交叉污染空白分析时，交叉污染百分含量为0.6%(0.32 mm DB-ALC2)。 G1888具有一个新的特点，可以让用户在G1888键盘上设定放空吹扫时间，这一参数一确定，当完成了阀进样以后，放空阀开始打开一直保持到设定的最大分析周期，这一附加的吹扫时间可以进一步减少交叉污染作用。结果列于表4中，这里使用了30秒的缺省的放空吹扫时间。 表4. 交叉污染试验，使用每个组分为0.5%的混合物进行连续6次分析，然后进行水/内标空白实验求峰面积的平均值。使用0.53mm色谱柱系统 DB-ALC1 乙醛 甲醇 乙醇 丙酮 异丙醇 正丙醇 平均峰面积 1764 7523 3268 5600 8116 1166 空白峰面积 31 57 47 * * 1179 面积比 0.02 0.01 0.01 1.01 *没有测出 预计火焰离子化检测器，对有关的被测物在血醇分析系统的浓度范围内具有很好的线性关系。如图4和图5所示，在大口径色谱柱系统得到证实，图5是0.32 mm色谱柱系统的结果，显示了0.32mm色谱柱系统的回归系数。 图4. 使用0.53mm DB-ALC1色对柱对图中的标准化合物的校准曲线 图5.使用0.53 mm DB-ALC2色谱柱对图中的标准化合物的校准曲线 表5. 0.32mm色谱普系统的线性(R)；浓度从0.005到1.0 g/dL DB-ALC- 乙醛 甲醇 乙醇 丙酮 异丙醇 正丙醇 甲乙酮 0.99981 0.99946 0.99931 0.99993 0.99990 0.99983 0.99961 0.99985 0.99944 0.99962 0.99993 0.99990 0.99982 0.99946 系统的k因子 系统的k因子，或响应因子可定义为(内标面积×EtOH在标样中的浓度)/(EtOH在标样中的面积)。系统的k因子可以用6到10次连续测定0.1或0.15 g/dL EtOH标样得到。每一个样品得到的结果与平均值的偏差应当小于±1.0%，参见表2，这是0.32mm色谱柱系统上k校正因子的相对标准偏差。对每一个样品测定的k校正因子有一个极限值，分析测得的k校正因子应该落在实验室已经建立值的允许范围之内，典型情况下使用±3%的平均值。 表6显示对每个色谱柱系统在进行40次分析和六种不同浓度情况下的稳定性，计算40次浓度与开始时浓度之差小于1%。 表6. 五个标样第40次分析对第1次分析的百分偏差 色谱柱 标程值 DB-ALC- g/dL MeOH 乙醛 EtOH IsoPrOH. 丙酮 0.01 0.65 -1.09 0.50 -0.08 -0.78 0.05 0.74 2.05 0.70 0.84 1.38 0.10 0.46 0.49 0.13 -0.19 -0.02 0.25 0.10 2.26 -0.17 0.10 1.08 0.35 0.23 0.00 -0.44 0.13 -0.06 0.50 0.27 0.73 -0.48 0.09 0.29 DB-ALC- 2 0.01 -1.32 0.32 0.25 -0.80 -0.38 2 0.05 1.99 0.46 0.63 1.36 0.63 0.10 0.31 0.09 -0.40 -0.18 -0.43 2 0.25 2.15 -0.60 -0.15 1.02 0.05 2 0.35 -0.18 0.11 -0.16 -0.13 0.01 2 0.50 0.71 0.27 -0.12 0.20 -0.29 在前40次连续分析的校正曲线是基于表中所示的六个浓度得到的。 虽然瑞典和挪威有更为严格的极限量0.2 g/L[1]，但是在欧盟，血醇的极限量是0.5或0.8g/L， 此外在许多国家对年青的司机有更为严格的要求，主要是测量呼吸和血液中的乙醇。在一些国家要求必须检测血液中的乙醇。不象在美国，检测所用的内标最常用的是特丁醇。图6A和6B显示其色谱图，其中用特丁醇用作内标。但是要注意某些潜在的共流出化合物，包括在DB-ALC1上的特丁醇/丙酮和DB-ALC2上的特丁醇/乙腈。 6 图6. 使用t-丁醇作内标的血醇分析色谱图色谱柱：30m×0.32 mm DB-ALC1(图6A)和DB-ALC2(图6B)峰识别：1.乙醛，2.甲醇，3.乙醇，4.丙酮，5.异丙醇，6.特一丁醇，7.n-丙醇，8.甲乙酮 尽管在这一工作中没有证实，但是在双柱系统的血醇分析标准组分中也对二乙醚、己烷、氯仿、乙酸乙酯和甲苯进行了分离[2]，色谱程序的变化需要对其进行优化。 化学工作站软件 开发了G1888顶空进样器的软件，它可以全面控制所有仪器的参数，同时也把同一序列表用于安捷伦液体进样器。这一软件可以作为GC ChemStation(G2922A)的附加软件来购买，它可以对顶空进行全面的综合控制。要求化学工作站的版本为A.09.03或更新，图7是这一软件的序列日记表图形举例。 图7.使用Agilent G1888顶空进样器时表示时间序列记录表窗口的举例，也创建了一个序列记录文件 所有与样品瓶处理有关的主要事件都按时间顺序列出，如果安装了安捷伦安全软件包，该软件还符合21 CFR Part 11的要求。可以使用两个下拉式菜单来设定进样器，一个设定全局性参数，如LAN的地址和样品瓶大小。而另外一个是打开一个对话框，用以设定样品序列时间和系统的温度。 结论 用顶空进样器进行血醇分析的关键参数包括分析时间、分离度、重现性和交叉污染作用，这里讨论的两个恒温系统分析周期很短，不到5 min，这一时间取决于内标的选择。结合使用G1888的70个样品瓶的样品瓶架可以达到高通量的分析。DB-ALC1和DB-ALC2色谱柱也使样品的分离度很好，使乙醇与常见的干扰物得到分离。在实验部分已经说明k因子在浓度为0.01到0.5 g/dL的范围内与系统平均的k因子的偏差小于1.5%。 这里叙述的顶空-气相色谱系统可以对法医分析要求的血液或其他生物基体中的乙醇浓度进行可靠的测定。尽管通常使用一支色谱柱可以满足要求，但是双柱方法可以得到附加的确证以及分离应用，而并不增加分析时间。交叉污染是高通量分析实验室中的一个常见的问题，这里通过使用惰性流路通道、改进热的控制和程序放空吹扫几项技术的结合，减少了交叉污染作用。G1888顶空进样器为法医实验室增添有用的手段，因为美国和其他国家在(DUI)法规的影响下逐步走向强制执行血醇的检测。 ( 参考文献 ) ( 1. B J lood Alcohol Concentration L imits Worldwide， ICAP Reports 2002 1 1 ， May， www.icap.org. ) ( 2. E . K uhn， M. Datta， and J. E l lis，“Separation and Iden-tification of Blood Pollutants”， Agilent Technologies， publication B-0328 Rev.2. ) ( http：//www.agilent.com/chem ) 如需详细信息 ( 如需了解有关我们产品和服务方面的详细信息，请访 问安捷伦公司的网站www.agilent.com/chem. ) www.agilent.com/chem 安捷伦公司对本材料中可能有的错误或有关装备、性能或使用这一材料而带来的意外伤害和问题不负任何责任。 本材料中包含的信息、说明和规格，将来如有变动，恕不另行通知。 Siltek是Restek公司的注册商标 安捷伦科技公司，2004 中国印刷2004年4月21日5989-0959CHCN Agilent Technologies ...Agilent Technologies