Gerstel应用-全自动酶法水解-高效移液萃取（DPX）-液相色谱质谱质谱（LCMSMS）联用分析尿液样品中的疼痛治疗药物-AN201401

Tegent德祥 全自动酶解-高效移液萃取(DPX)-液相色谱/质谱/质谱(LC/MS/MS)联用分析尿液样品中的疼痛治疗药物 Fred D. Foster， John R. Stuff， Edward A. Pfannkoch GERSTEL， Inc.， 701 Digital Dr. Suite J， Linthicum， MD 21090， USA William E. Brewer Department of Chemistry and Biochemistry， University ofSouthCarolina， 631 Sumter St. Columbia， SC 29208，USA 关键词 样品制备，液相色谱/质谱/质谱 (LC/MS/MS)，高通量全自动化，高效移液萃取(DPX)，尿样，葡萄糖苷酸 摘要 许多疼痛治疗药物的新陈代谢主要机理都包含分析物与葡萄糖醛酸的结合。当测定尿液基质中的药物浓度时，为了获得准确的分析结果，分析物必须解离，常用的方法是利用酶(例如β-葡萄糖醛酸酶)将分析物水解。典型的水解过程需要将样品在恒定的温度下保持很长的时间，通常也是手动操作。 本文介绍了一种高通量全自动测定常见疼痛治疗药物的分析方法，通过 GERSTEL 多功能样品前处理平台(MPS)可轻松地实现全自动的酶解过程，并结合全自动萃取、净化过程后，直接将样品引入至LC/MS/MS。 引言 临床及法医学领域的化学家们通常需要在分析样品前进行一系列复杂的样品处理过程，以保证尿样中分析物浓度测定的准确性。这些复杂的样品处理过程通常始于酶解(例如使用β-葡萄糖醛酸酶水解)，目的是将分析物从结合形式转变为原始药物形式。为了保证水解过程的完整性及好的重现性，针对于特定的酶，需要优化及控制水解过程的 pH 值、温度及水解时间。 为了得到药物化合物及代谢物的低检出限，通常需要去除样品基质干扰。这些干扰物通常产生于水解过程，或自然生成于尿液中。在法医分析学领域，固相萃取(SPE)被广泛用于水解后尿液样品的制备及净化。大多数SPE 过程需要的溶剂量相对较大，处理样品时间长，从而增加了每个样品的成本，检出限较高。 高效移液萃取(DPX)作为一种可替代传统 SPE 的方法，可利用少量的溶液，高效、快速地完成萃取过程。DPX 是一种新型的萃取技术，将松散的固定相置于吸管内，吸管内的固定相与样品高效地接触后，快速地将被测物质萃取出来。DPX 技术的主要优势有：萃取速度快、回收率高、溶剂使用量非常小、全自动化的萃取过程及进样过程。 ：全自动的水解、萃取过程、及随后的 LC/MS/MS分析，实现了尿样中药物分析的高通量。利用 GERSTEL MPS， 可全自动化实现如下操作：转移酶解过程中所有溶液，控制样品温度及恒温时间，通过 DPX、利用 DPX-RP-S 专利吸附剂萃取尿样中水解后的被测物质 直接将 DPX洗脱液引入到 LC/MS/MS。 实验部分 材料： 表1中所列所有化合物的储备溶液均购于Cerilliant。将葡苷糖苷酸共轭物储备液用水稀释至合适浓度制成中间浓度的储备溶液，用于评价不同的分析物。 氛代物 d3-Morphine， d3-Morphine-3-β-D-glucuronide， d5-Oxazepam， d5-Oxazepamglucuronide， d3-Oxymorphone， d3-Oxymorphone-3-B-D-glucuronide 购于 Cerilliant。中间浓度的内标储备溶液由内标储备液和甲醇水溶液(1：1)稀释而成。 高浓度校准溶液和中间质控点QC尿样的制备：将各种葡萄糖苷酸共轭物储备液加入到无目标化合物的尿液中制成高浓度的校准溶液(见表1)。将高浓度校准溶液稀释成1000、500、100、50、10、5、1 ng/mL。QC尿样为75ng/mL。 2型β-葡萄糖醛酸酶来源于罗曼蜗牛 (cat.#G0876-5mL)， 购于 Sigma-Aldrich。新的尿液由一个男性志愿者提供。其它的溶液和试剂都为试剂纯级。 仪器： 全自动动水解和 DPX 过程由双头的 MPS XL(带有DPX选项及 MAESTRO 软件，如图1)完成。分析过程由Agilent 1290 HPLC， Agilent 6460三重四级杆质谱(喷射流离子聚焦)， GERSTEL MPS XL (带有清洗工作台)完成，色谱柱为 Poroshell 120， EC-C18 column(3.0*50 mm， 2.7 um)。样品由 Cheminert C2V 六通阀(0.25mm)引入，2uL 不锈钢定量环。 图1 GERSTEL MPS XL (带DPX功能)用于全自动酶解及 DPX-LC/MS/MS 样品预处理： 全自动水解程序： 双头的 MPS XL 用来自动水解尿液样品。将 1mL的尿样手动加入到自动进样器的小瓶 中，小瓶加盖并放置在相应的自动进样器托盘上， MPS 转移75pL 的工作内标溶液，50uLβ-葡萄糖醛酸酶(B-Glucuronidase)， 和250 pL 0.66M 醋酸缓冲液(pH值为4)到进样瓶中，这时放在加热盘上，55℃孵化2小时。然后把这个小瓶返回到它原来的位置，取250uL水解后的尿液样品转移至一个干净的敞口小瓶进行自动化的 DPX 净化和进样。 全自动 DPX处理样品流程(净化过程) 图2显示了一般 DPX净化的流流。 图2自动DPX处理尿样流程示意图 自动 DPX用于此方法包括以下步骤： 1.用2.5 mL DPX 注射器从快速溶剂输送站吸取750 uL乙腈 2.从DPX托盘上取一个新的 DPX小柱 3.500 uL 乙腈流经 DPX小柱，后流入 MPS 托盘上的尿液样品中 4.等待6秒让乙腈完全润湿 DPX吸附剂 5.全部样品随着 1400 uL空气吸入到 DPX小柱 6.平衡5秒后，将 DPX 小柱中的溶液，连同 DPX 注射器里剩余的乙腈重新注射回原敞口小瓶里 7.移动 DPX 小柱到 PipWaste 位置，扔掉 DPX小柱 8.取250 pL敞口小瓶中的上层液体，到一个干净的、空的、有隔垫的2mL密封液相小瓶里 9.加入250 pL 0.05%甲酸的水溶液于液相小瓶中稀释提取物 10.取 25uL 稀释后的样品进样到 HPLC LC分析条件： 泵：等度，50： 50(A： B)，流速=0.3mL/min 流动相： A-5mMM甲酸铵水溶液，加入0.05%的甲酸； B-含0.05%甲酸的甲醇 运行时间：10 min 进样体积：2uL(满环进样技术) 柱温：55℃ MS分析条件： 操作：正相电喷雾模式+Agilent 喷射流离子聚焦 干燥气温度：350C 干燥气流量：5L/min 雾化器压力：35 psi 鞘流气温度：250℃ 鞘流气流量：11L/min 毛细管电压：4000V 喷嘴电压：500V 详细的质谱采集参数可咨询厂家。 结果和讨论 表1列出了质量参数转换和各自的破碎和碰撞能量，对最高浓度的校准溶液进行评估，并依据描述的自动化水解和萃取过程，测定了分析物的检测限。 表1化合物及葡萄糖苷酸共轭物质量参数的转换和 MS/MS 参数 Compound Precursor lon [m/z] Product lon [m/z1 Fragmentation [V] CE [V] High conc. [ng/mL] LOQ conc. [ng/mL] Morph3 gluc 462.2 286.3 150 30 1000 1 165.1 150 70 d3-Morph3 gluc 465.2 289.3 150 30 165.1 150 70 Morphine 286.2 165.1 158 41 n/a n/a 152 158 60 d3-Morphine 289 165.1 153 40 152 153 68 Oxazepam gluc 463.1 287.2 120 10 1000 1 241.2 120 40 d5-Oxazepam gluc 468.1 292.2 120 10 246.2 120 40 Oxazepam 287.1 269 133 20 n/a n/a 241 133 21 d5-Oxazepam 292.1 246.1 123 24 109 123 40 Oxymorphone gluc 478.2 284.3 140 30 1000 1 227.2 140 50 d3-Oxymorphone gluc 481.2 287.3 150 30 230.2 150 50 Oxymorphone 302.1 227.1 133 28 n/a n/a 198.1 133 48 为了证明自动化能够很好地完成β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)水解尿液样本，分别取三份尿液样本，加了浓度为1000 ng/mL 的奥沙西葡糖苷酸(Oxazepamglucuronide)，分别进行手动水解和自动水解过程。水解后，所有样品通过 DPX-LC/MS/MS进行提取和分析。如表2所示，手动和自动水解的两组结果之间只有4%的差异。 表2手动与自动水解结果 Oxazepam (1000 ng/mL) Autom. Hydrolysis [Response] [Response] Replicate 1 77113 77329 Replicate 2 79498 84160 Replicate 3 73218 78455 mean 76610 79981 SD 3170 3662 %cv 4.14 4.58 % Difference 4.31 将全自动的β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)水解过程与典型的加酸水解过程相对比。加酸水解是将相等量的浓盐酸加入到加有1000 ng/mL 的羟吗啡酮-3-B-D-葡糖苷酸(Oxymorphone-3-B-D-glucuronide) 或去甲羟基安定葡糖苷酸(Oxazepam glucuronide) 的尿液中，然后在100℃加热90min。等样品冷却至室温后，在萃取前将样品的 pH 值用氢氧化铵调节到4，连同β-葡萄糖醛酸酶(B-glucuronidase)酶解样品采用 DPX-LC/MS/MS 进行分析。为保证最终的浓度是相同的，在萃取前将样品的体积进行调整。如表3，酸解方法，主体药羟吗啡酮(Oxymorphone)与去甲羟基安定(Oxazepam)的浓度测定值较低。由于羟吗啡酮-3-B-D-葡糖苷酸(Oxymorphone-3-B-D-glucuronide)和去甲羟基安定葡糖苷酸(Oxazepamglucuronide)也没有响应，因此可推断出主体药浓度低是由于加酸水解时主体药的进一步降解或离子化时有干扰而不是不完全水解。 表3水解作用的对比 Replicate (1000 ng/mL) Oxymorphone gluc Oxymorphone [Response] Oxyazepam gluc[Response] Oxazepam[Response] [Response] 1 B-gluc hydrolyzed 1 - 29493 - 2332971 2 B-gluc hydrolyzed 2 29218 - 2334096 3 B-gluc hydrolyzed 3 - 28766 - 2299385 1 HCl hydrolyzed (pH 3-4) 2883 5123 2HCl hydrolyzed (pH 3-4) - 2678 - 1994 3 HCl hydrolyzed (pH 3-4) - 2908 1542 自动化的优点之一是使实验设计更容易，将实验设计中的所有操作步骤自动化，从而实现快速的优化与对比。采用0.66M醋酸盐缓冲液，在不同pH值下对β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)酶解过程进行检测，可以很容易的在 MAESTRO 软件中设定并由 MPS实施，如图3。图4显示了去甲羟基安定测定的质谱结果，从图中可以看出，采用 0.66M醋酸盐缓冲液调节 pH值，在pH为4.0(A)， 4.5(B)， 5.0(C)时测定结果没有明显的差异。 图3采用 MAESTRO 序列表，利用样品制备程序，自动化地实现β-葡萄糖醛酸酶水解时加入不同pH值的0.66M 醋酸盐缓冲液 图4不同 pH 值去甲羟基安定的质谱图 醋酸盐缓冲液的 pH 值分别为4.0(A)、4.5(B)、5.0(C)时，没有明显差异 为了保证自动水解完全，并能采用 DPX-LC/MS/MS 方法对尿样中的分析物进行定量，标准品及QC 样品都加入了葡萄糖苷酸共轭物吗啡-3-β-D-葡糖苷酸或去甲羟基安定葡糖苷酸，然后采用前面所述的 LC/MS/MS 分析药物本体及共轭物。实验结果表明，葡萄糖苷酸共轭物无响应，证明所分析的样品被完全水解。 重复测定6次75 ng/mL QC样品，计算吗啡与去甲羟基安定全自动水解-DPX-LC/MS/MS方法的准确度与精密度。表4表明了两种化合物准确度与精密度的结果。吗啡与去甲羟基安定的准确度分别为 102%-96.3%，吗啡与去甲羟基安定的精密度分别为3.52%与4.70%c 表4全自动酶解- DPX-LC/MS/MS 方法的准确度与精密度 Morphine-3-B-D- glucuronide (QC Sample，75 ng/mL) Morphine[Area Ratiol Calc. Accuracy%] Replicate 1 0.0352 101 Replicate 2 0.0378 109 Replicate 3 0.0360 104 Replicate 4 0.0350 101 Replicate 5 0.0350 101 Replicate 6 0.0342 98.6 mean 0.0355 102 SD 0.00125 3.65 % cV 3.52 3.57 Oxazepam-glucuronide(QC Sample， 75 ng/mL) Oxazepam [Area Ratio1 Calc. Accuracy %1 Replicate 1 0.0511 92.0 Replicate 2 0.0516 93.0 Replicate 3 0.0580 105 Replicate 4 0.0537 96.7 Replicate 5 0.0541 97.4 Replicate 6 0.0523 94.2 mean 0.0535 96.3 SD 0.00251 4.54 %CV 4.70 4.71 图5是吗啡和去甲羟基安定的线性曲线图。二者线性回归曲线的R值均大于0.99。 图5吗啡和去甲羟基安定的标准曲线图 结论 通过以上研究，我们可以得出如下结论： 1.利用GERSTEL 双头全自动处理平台 MPS XT 成功实现了酶解与自动高效移液萃取方法的自动化，并用此方法定量分析了尿液中葡萄糖核苷共轭分析物。 2.分析物可以快速而稳定地从酶解了的尿液样品中分离，并通过 DPX 提取， Agilent 6490三重四级杆定性定量分析。 3. 该方法全部为自动化过程，标准曲线R²值大于0.99，两种葡萄糖核苷共轭分析物，吗啡和去甲羟基安定的最小检出限可达 1 ng/mL。 4.该方法结合了自动酶解，自动高效移液萃取与 LC/MS/MS， 得到了良好的准确度与精密度。吗啡和去甲羟基安定的准确度分别为102%和96.3%，精密度(变异系数)分别为3.52%和4.70%。 ( 参考文献： ) [1]“利用 DPX-LC/MS/MS 快速清理、综合筛选尿液中的疼痛管理药品”， Gerstel AppNote2012-01 GERSTEL 产品由德祥科技有限公司独家代理。索取更多产品及应用资料，请与我们联系。 北京：樊宝明 13466573827 baoming fan@tegent.com.cn 上海：姚桂燕 18017339768 guiyan yao@tegent.com.cn 广州：常蓓蓓 186 66016734 tracy chang@tegent.com.cn 成都：陈婷婷 18683370704 tingting chen@tegent.com.cn AN-