水质中微生物检测方案

水质微生物检测实验 通过本试验，了解食品检验中水质微生物检测的基本方法。 一、水样的采集 1.自来水 先将水龙头用清洁布拭干，并用摄子夹消毒棉花沾酒精灼烧水龙头3min灭菌，再打开水龙头使水流5min后，以灭菌的三角瓶或生理盐水瓶接取水样，以待检测。 2.池水、河水或湖水 应取距水面10～15cm的深层水，先将灭菌的带塞的玻璃瓶瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去瓶塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞塞好，再从水中取出，最好立即检验，否则需放入冰箱保藏。 二、细菌菌落总数测定（SPC） 1.样品稀释与制备 （1）自来水：用灭菌吸管吸取1mL 水样，注入灭菌的培养皿中，共做两个平皿。然后倒入约15 mL已溶化并冷却至45℃左右的营养琼脂培养基，并轻轻摇晃，使水样与培养基充分混匀。待冷却后倒置于36±1℃培养24h，进行菌落计数。 （2）池水、河水或湖水等：用无菌吸管吸取检测水样1mL于第一支9mL生理盐水试管中，摇匀，再从第1支稀释试管中吸取1mL于第2支生理盐水的试管中，如此类推，做成一系列的稀释液。一般稀释度可选择为10-1、10-2、10-3、10-4，若水样混浊或污染严重的可再进一步稀释至适宜稀释度。自最后三个稀释度的试管中各吸取1mL稀释液于培养皿中，每稀释度做二个平皿，倾注入约15mL 已溶化并冷却至45℃左右的营养琼脂，并轻晃平皿，使之混匀，待冷却后倒置于36±1℃培养箱中培养24h。　 2.菌落计数方法 待平皿培养24h长出菌落后作平皿菌落计数，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏，在记下各皿的菌落数后，求出同稀释度的2个平皿的平均菌落数。 3.菌落计数的报告： ①平皿菌落数的选择：选取菌落数在30～300之间的平皿作为菌落总数测定标准，一个稀释度使用两个平皿应采用其平均数，其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可计算半个平皿后乘2以代表全皿菌落数。 ②稀释度的选择：　 a.应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之(见表例1)。 b.若有两个稀释度，其生长之菌落数均在30～300之间，则应视二者之比如何来决定，若其比值小于2，应报告其平均数：若大于2则报告其中较小的数字(见表例2及3)。 c.若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表例4) d.若所有释稀度的平均菌落数均小于30，则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表例5)。 e.若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表例6)。 f.若所有稀释度均无菌落生长，则以小于(＜)1乘以最低稀释倍数报告之(见表例7)。 　　 　　　　　　　　　　细菌菌落总数计算方法（SPC法） 例次 不同稀释度平均CFU 两稀释度CFU之比 菌落总数报告CFU/mL(g) 备 注 10-1 10-2 10-3 1 1356 164 20 － 16400或1.6X104 两位以后的数字采用四舍五入的方法去舍。 2 2760 295 46 1.6 37750或3.8X104 3 2890 271 60 2.2 27100或2.7X104 4 ＜3000 1650 513 － 513000或5.1X105 5 27 11 5 － 270或2.7X102 6 无法计数 305 12 － 30500或3.5X104 7 0 0 0 ＜10 ③菌落数的报告：菌落数小于10，按＜10报告；在100以内时，按其实有数报告；大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。 三、大肠菌群检验： 大肠菌群系指一群在36±1℃24h能发酵乳糖产酸、产气，需氧和兼性厌氧G-无芽孢杆菌，包括埃希氏大肠杆菌、克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌和柠檬酸杆菌等。该菌群主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价水质的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。 水中大肠菌群数系以每1L水样中大肠菌群最近似数(M.P.N)个表示。 瓶装水、饮用水、水源水和游泳池水卫生标准 水　　　　　　　　　　源 大肠菌群 (个/L) CFU/mL 瓶装水（矿泉水、纯净水） ＜2 ＜50 饮用（自来）水 ＜2 ＜100 水源水 准备加氯消毒后供饮用的水 ≤1000 准备净化处理及加氯消毒后供饮用的水 ≤10000 游泳池水 ＜100 ＜1000 1. 生活饮用水或食品厂生产用水的检验： （1）初步发酵试验 在2个各装有50mL 叁倍浓缩的十二烷基硫酸钠乳糖蛋白胨发酵管中，各加入100 mL水样，将10支含有5mL叁倍乳糖蛋白胨发酵管中各加入10mL水样，于36±1℃培养24h，24h未产气者继续培养至48h。若水质条件变化不大的饮用水（或生产用水）可采用3个装有50mL 叁倍浓缩的十二烷基硫酸钠乳糖蛋白胨发酵管分别加入100mL 水样。 （2）分离培养 将产气的发酵管分别接种在伊红美兰琼脂平板，置36±1℃培养18～24h，然后取出，观察菌落形态，凡菌落或菌苔符合深紫黑色，有金属光泽；紫黑色，不带或略带金属光泽；淡紫红色，中心颜色较深或紫红色菌落特征的均应进一步作革兰氏染色和证实试验。 （3）证实试验 在上述平板上，挑取在此平板生长符合上述特征的菌落，或可疑无法判断的菌落1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃培养24±2h，观察产气情况，凡乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性；如乳糖发酵管不产气或革兰氏染色阳性，则报告为大肠菌群阴性。 （4）根据证实为大肠菌群阳性的管数，查下列表。 饮用水大肠菌群检索表（接种水样总量300mL，其中100mL2份，10mL10份） 100mL水样阳性管数 10mL水样阳性管数　 　　　　0 　　　　1 　　　　2 个/L 个/L 个/L 0 ＜3 4 11 1 3 8 18 2 7 13 27 3 11 18 38 4 14 24 52 5 18 30 70 6 22 36 92 7 27 43 120 8 31 51 161 9 36 60 230 10 40 69 ＞230 大肠菌群变异不大的饮用水检索表 阳性管数 0 1 2 3 接种水样总量300mL（ 3份100mL） 1L水样中大肠菌群数 ＜3 4 11 ＞18 2．池水、河水或湖水等水源水的检验 将水样稀释成10-1、10-2。分别吸取1mL的 10-1、10-2的稀释水样和1mL原水样，各注入装有10mL单料乳糖蛋白胨发酵管中，另取10mL原水样注入装有5mL叁倍十二烷基硫酸钠乳糖蛋白胨发酵管中（接种水量为11.11mL，若水源水严重污染则取样量应为1.111mL，即原水样、10-1、10-2、10-3；若污染轻度水取样为111.1mL，即100倍原水样、10倍原水样、原水样和10-1）。置36±1℃培养24±2h，观察产气情况，若有产气者则按上述的分离培养与证实试验进行，最后根据产气管数查表报告。 四、培养基配方 （1）生理盐水　　　　NaCl　　9g 水　1000mL （2）伊红美兰培养基（EMB） 蛋白胨水琼脂培养基　　100mL （蛋白胨　10g　NaCl 5g 琼脂20g 水1000mL pH7.6 121℃20min） 　　乳糖　2g　　2%伊红液　2mL　　0.65%美兰液　1mL　 将已灭菌的蛋白胨水琼脂溶化，冷却至60℃左右时，按无菌操作加入乳糖、伊红液和美兰液（这三种应分别在115℃灭菌20min），摇匀后倒平板。 （3）乳糖发酵液（供复发酵用） 　　蛋白胨　10g　　乳糖　5g　　NaCl 5g 　水　1000mL　 pH7.4 （4） 营养琼脂 蛋白胨　10g　　牛肉膏　3g　　NaCl 5g　　琼脂　20g 水　1000mL 　 pH7.0-7.2　　121℃　20min。 （5）单料十二烷基硫酸钠乳糖发酵液配方： 蛋白胨　10g　　　牛肉膏　　3g　　　乳糖　　5 g　　　NaCl 5g 1.6%溴甲酚紫乙醇液　　1mL 　　　十二烷基硫酸钠　0.1g 　　水　　1000mL　　pH7.2～7.4 将上述除指示剂外溶于水，调pH7.2～7.4，再加入指示剂。 （6）叁料十二烷基硫酸钠乳糖发酵液配方： 按单料十二烷基硫酸钠乳糖发酵液配方要求各营养成分为叁倍，而加水不变。 水源水大肠菌群检索表 接种水量11.11mL，分别为10、1、0.1 和0.01mL各1份 接种水样/mL 每L水样中大肠菌群数 10 1 0.1 0.01 － － － － ＜90 － － － ＋ 90 － － ＋ － 90 － ＋ － － 95 － － ＋ ＋ 180 － ＋ － ＋ 190 － ＋ ＋ － 220 ＋ － － － 230 － ＋ ＋ ＋ 280 ＋ － － ＋ 920 ＋ － ＋ － 940 ＋ － ＋ ＋ 1800 ＋ ＋ － － 2300 ＋ ＋ － ＋ 9600 ＋ ＋ ＋ － 23800 ＋ ＋ ＋ ＋ ＞23800 若接种水量为111.1mL则上述数字减少10倍，若接种水量为1.111mL则上述数字增加10倍。 PAGE 4