使用拉曼光谱测绘在体外监测干细胞成骨分化的非破坏性方法

使用拉曼光谱测绘在体外监测干细胞成骨分化的非破坏性方法 简介 在过去的几年中，干细胞可分化为不同类型的细胞这一研究发现使干细胞研究得到不断发展。进而，这也为再生医学和基因疗法创造了新的可能性。 源自干细胞的骨髓能够分化为成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞。这些类型细胞分别负责产生骨骼、软骨和脂肪组织。在体外监测细胞的分化是目前研究所面临的挑战。常用方法包括细胞染色和分类，但是这些技术非常繁杂且容易出错，还会破坏细胞。 图1.源自干细胞的骨髓分化为成骨细胞谱系。在不同阶段，细胞会分泌生长因子促进分化。通过在蛋白质基体上观察到矿物质晶体分泌物可证实已分化为成熟的成骨细胞。 本文中，拉曼光谱测绘为在体外监测干细胞成骨分化(生成成骨细胞-形成骨骼的细胞-图1)提供了一种非破破性方法。成骨分化是一个在很大程度上受生长因子可溶性影响的逐步完成的过程1，因此需要使用特殊的成骨分化介质来帮助骨髓间充质干细胞(MSC)分化为成骨细胞。首先，将干细胞调用到分化历程中，引入第一批分化基因。接下来，分化本身将涉及引入整个分化基因组。最后，特定基因蛋白的积聚标志着细胞的成熟。? 图2.(左)毛细管底部的细胞团。(中)毛细管中细胞的拉曼谱图。(右)代表细胞的拉曼光谱。 图1列出不同成骨分化阶段中骨髓间充质干细胞的常见基因表达图。I类胶原表达起始于细胞从前成骨细胞到成骨细胞的分化。而成熟成骨细胞分化则由在蛋白质骨架上分泌出矿物质来表示。 拉曼光谱所具有的优势在于，不仅能够检测出蛋白质含量与结构的变化，而且还能检测出蛋白质基体上矿物质的沉积。 细胞分化的拉曼光谱监测 要监测干细胞的分化，需要将大约5×105个人类骨髓间充质干细胞制粒，并置于2.5 mm 直径的石英毛细管的底部(图2，左)，然后在毛细管中培养21天。使用含有地塞米松和抗坏血酸的成骨分化生长介质供给细胞，并将毛细管置于37℃、5% CO，环境下的15 mL 锥形瓶中培养。每3到4天更换一次毛细管中的生长介质(一百微升)。分六个时间点检测所有毛细管：第0天、第3天(加入成骨介质后的36小时)、第7天、第10天、第15天和第21天。根据毛细管底部的细胞团形状，每个拉曼谱图一般含有12- 15个测绘点(图2，中)。 本研究是在具备电动平台的 PerkinElmer RamanStation"400F仪器上进行，所使用的的绘参数如下：波长范围为1800-500cm²、在谱图的每个测绘点上90s内获取物的2次积聚、0.2 mm 步距。尽量缩短分析时间以便将样品离开培养箱的时间减至最少。 在图2(右)细胞光谱中所观测到的典型拉曼谱带为1004 cm²(C-C环呼吸：苯丙氨酸/蛋白质)、1305 cm(CH，变形：蛋白质)、1445 cm'(CH，剪式振动：蛋白质)和1660 cm(I类氨基化合物：蛋白质)。3 当开始发生矿物质沉积时，可观测到 960 cm'(v P-O伸展振动：类似于磷灰石的矿物质)处的拉曼谱带。 矿物质开始沉积之后，也可观测到 1070 cm(v； PO与vCO伸展振动：类似于磷灰石的矿物质)。 在图3中，从每个时间点的拉曼谱图上获取的平均光谱都具有一定偏移与覆盖，可使用1550-1750峰对谱图进行归一化。 图3.骨髓间充质干细胞成骨分化期间每个观测时间点的平均拉曼光谱图。黑色线表示960 cm²处矿物质谱带，灰色线表示 1070 cm²处矿物质谱带。 从第7天开始在960 cm 谱带处会逐渐出现v P-O伸展振动峰，且强度逐渐增加直到第21天。使用较传统的细胞培养技术(微孔板)，通常会在开始培养的两周之后才观测到发生矿化作用。此处，早在第7天就可检测到矿化作用。然后，通过计算每个光谱中矿物质与基体的比率(MTMR)来直接监测矿化作用。 每个光谱中的矿物质与基体的比率是通过将960 cm1VP-O伸展振动谱带峰值除以 1450 cmCH剪式振动谱带峰值来计算(图4)。可以清楚地看到，矿物质与基体的比率(表示矿物质总含量)正如所期望的那样随着时间的推移而增大。1070 cm处谱带强度的增大表示碳酸根离子正进入到矿物质晶格中。矿物质的碳酸化作用会加快矿物质成熟，增加正常骨骼。 图4.早在第7天就检测到矿化作用，然后通过计算每个光谱中矿物质与基体的比率直接监测矿化作用。 PerkinElmer， Inc. 地址：上海张江高科园区李冰路67弄4号 邮编：201203 电话：(021)38769510 传真：(021)38791316 www.perkinelmer.com.cn 结论 通常使用染色技术(例如茜素红染色)确定成骨细胞矿化作用的程度。但是，染色会破坏细胞，在每个时间点的过程上花费的时间都超过一个小时，而且还需要制备完全匹配的几组样品来进行平行 RNAA4研究。因此，要在不同时间点监测成骨分化和矿化作用，就需要多次细胞培养，并且不能启用对各个时期中的相同细胞的监测。 本文中，我们将拉曼光谱测绘作为 -项非破坏性技术使用，在不到一个小时的时间内监测骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞谱系的过程。 拉曼光谱使样品分析变得更为快速，而无需进行繁琐的染色步骤，并将必须制备和培养的细胞系数量减少了一半。此外，使用这种方法，还可将 RNA 和矿化作用数据相关联，显著提高研究的可靠性。 接下来进一步的研究可指出仅使用拉曼光谱分析能否同时提供成骨细胞矿化与细胞谱系的信息。 ( 参 考文献 ) ( 1 Marie PJ， FromigueO.Os t eogenic differentiation ofhuman marrow-derived m e senchymal stem cells.Regenerative Medicine 2006 ， 1(4)，539-548。 ) ( 2 Delorme B， Chateauvieux S， Ch a rbord P. T he concept of mesenchymal stem cells. Regenerative M e dicine 2006， 1( 4 )497-509。 ) ( 3Morris MD， F inney W F. R ecent developments in Raman and infrared spectroscopy and imaging of bone tissue. Spectroscopy 2004， 18，155-159 。 ) 4 Stewart S， Shea DA， Tarnowski CP， Morris MD， Wang D，Franceschi R， Lin D-L， Keller E. Trends in earlymineralization of murine calvarial osteoblastic cul- tures： aRaman microscopic study. Journal of Raman Spectroscopy2002，33(7)，536-543。 要联系作者，请发送电子邮件，邮箱地址为cranen@wyeth.com. ( 要获取全球办事处的完整列表，请访问 www.perkinelmer.com.cn/ContactUs ) ( ◎2 00 9 P e rkin E lm e r ， In c. 保 留 所 有 权利。Per k inelmer徽标 和 外 观 设计是Pe r k in e l mer的 注 册商标。 文 中 提 及的其它非Perkin e l m er 及 其子公 司 所 有的 其它 商标 均为其各自所有者的财产。 P erki n e l mer保留随 时 更 改 此文档的 权 利 ， 恕不另 行 通 知 。对 于 编辑、 图 片 或排 版错 误 概不 承 担 任 何责任。 ) www.perkinelmer.com.cn