阿奇霉素中药典方法的实验条件影响探讨及实验建议检测方案(液相色谱柱)

Jan.29，20132Jing Yuan Street， BeijingEconomic Technological Development Zone，Beijing， China 100176Phone 010-6785-6801，FAX 010-6785-6882 LC Application Lab， Shiseido China No.31.BDA International Business Park， 阿奇霉素药典方法的实验条件影响探讨及实验建议 本实验按照阿奇霉素药典方法，使用资生堂 CAPCELL PAK C18 MGII S5：4.6mm i.d×250mm色谱柱，对部分实验条件可能造成的影响进行探讨。 1.新色谱柱平衡 资生堂 CAPCELL PAK C18 MGII S5：4.6mm i.dx250mm 色谱柱出厂保存溶液为 100%乙腈溶液，在使用流动相对其进行平衡前需使用20%乙腈(不含盐)冲洗色谱柱半小时，以替换色谱柱保存溶液。 在充分替换色谱柱保存液后，使用流动相 (50mM k2HPO4(pH=8.2)：CH3CN=45：55，i两相混合后超声充分溶解，过0.22滤膜后脱气使用或使用在线过滤器)在正常流速 1.0 mL/min 下平衡2小时后进样，结果如图1所示，由放大图可看出各个杂质都基本得到了良好分离。(检测器为 PDA 检测器，此检测器灵敏度很高，可检测出较多杂质峰) HPLC Conditions 色谱柱：CAPCELL PAK C18 MGII S5 4.6mm i.d.×250mm 流动相： 50mM k2HPO4(pH=8.2)：CH3CN=45：55 流速1.0 mL/min温温度检金测PDA210nm 25°C 样品浓度： Azithromycin：10 mg/mL 进样量：50pL 在此基础上进行重复性验证，结果如图2所示，阿奇霉素主峰保留时间已经基本稳定。 Minutes 图2阿奇霉素分析重复性验证 2. 色谱峰时间漂移的发现 在连续进样的同时，起初发现有一杂质峰(图中标示)保留时间不稳，延长保留时间后发现现杂质在约75min出峰，如图3所示。故当分析时间不充分时，可能会出现前一针未出完的杂质峰在后一针的色谱图里出现，导致色谱峰时间漂移现象出现。 Minutes 图3阿奇霉素分析杂质峰保留时间不稳探讨 3. 样品溶剂的影响 分别使用流动相和乙腈溶解样品，按相同方法进样后的结果如图4所示，二者主峰峰型未见明显差别。由于阿奇霉素药典方法中进样量以及进样浓度均较大，建议样品充分超声溶解并过滤膜，可能的情况下可配备预柱来延长色谱柱寿命。 Minutes 图4阿奇霉素分析不同样品溶剂影响 4. 柱温箱温度的影响 采用25、30、35、45℃四个温度，验证柱温对阿奇霉素保留时间的影响，结果如图5所示，随着柱温的升高，阿奇霉素主峰的保留时间有所延长。(建议选择柱温时，与室温温差不要过大，过大时可能会导致流动相在进入色谱柱后温度不易达到稳定而导致色谱峰漂移，本实验进行时室温约20℃，早晚温差<5℃) 图5阿奇霉素分析柱温的影响 5. 使用两个泵时的影响 由于阿奇霉素药典方法中盐浓度以及乙腈含量均较高，故一般建议使用--个泵进行试验，两个泵长时间使用可能会逐渐发生压力升高(系统或色谱柱堵塞)现象。图6结果为混合使用1-一个泵和使用两个泵的对比结果，由图可见在使用两个泵时，由于混合器不能在较短时间内充分混合，故基线不平平，可能会干扰部分杂质的检测，而使用一个泵时无此现象。 图6阿奇霉素分析流动相混合使用与不混合对比 综上所述，在使用资生堂 CAPCELL PAK C18 MGII S5：4.6mm i.d ×250mm 色谱柱进行阿奇霉素的药典方法分析时，需注意事项如下： 1.由于此实验流动相盐浓度较高，在实验前请将色谱柱保存液以及系统残存溶液替换为低百分比乙腈(如20%乙腈)，l以避免系统或色谱柱出现盐析。新CAPCELL PAK C18 MGII S5：4.6mm i.d ×250mm色谱柱出厂保存溶液为100%乙腈，请务必进行置换后再上流动相。 2.此实验色谱柱平衡时间较一般 C18分析平衡时间长，需至少2-3小时。 3.样品配制后需过滤膜，可能的情况下请配备预柱来延长色谱柱寿命。 4.流动相混合后使用，并充分超声溶解，过滤脱气。 5.阿奇霉素杂质峰较多，在遇到不规律出现的杂质峰且其峰型较宽的时候，，可考虑是否为分析时间不足所导致。 6.温度对阿奇霉素分析影响较大，请配备柱温箱。 7.实验结束后可使用相同有机相比例不含盐流动相对色谱柱进行冲洗并保存(1-2月保存，如更长时间保存请最终替换为100%乙腈)。 8.如果遇到色谱柱中盐析，压力升高的情况，可使用10%乙腈(不含盐)的流动相，在小流速下(0.1mL/min)长时间冲洗并观察压力变化，直至压力正常(也可能出现不可逆损伤，此时需更换新色谱柱)。 ( 注： 图中色谱峰线条不平滑是由于图像在复制过程中解像度问题引起的。 ) 杨茜 城田修