头孢克洛有关物质的测定 高效液相色谱法

一、摘要本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定头孢克洛的有关物质。色谱条件：C18色谱柱（4.6×250mm，5μm），流速为1.0mL/min，柱温为35℃，进样量为20μL，检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为220nm。实验结果：头孢克洛峰的保留时间为23.742min；头孢克洛峰与头孢克洛δ-3-异构体峰之间的分离度为10.92；头孢克洛峰的拖尾因子为0.96；峰面积小于对照溶液主峰面积0.5倍且大于对照溶液主峰面积0.1倍的杂质峰共有10个，且各杂质含量在0.11%~0.29%之间，总杂的含量为1.76%；对照溶液连续进样7针重复性测试中，头孢克洛保留时间的RSD为0.099%，峰面积的RSD为0.083%；头孢克洛灵敏度溶液的信噪比S/N为101.7。二、背景头孢克洛化学名为（6R，7R）-7-［（R）-2-氨基-2-苯乙酰氨基］-3-氯-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环［4.2.0］辛-2-烯-2-甲酸一水合物，为白色至微黄色粉末或结晶性粉末，微臭；在水中微溶，在甲醇、乙醇或二氯甲烷中几乎不溶。文档编号：LC-K2025-01-230613 头孢克洛有关物质的测定高效液相色谱法 一、摘要 本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定头孢克洛的有关物质。色谱条件：C18色谱柱 （4.6×250mm，5μm），流速为1.0mL/min，柱温为35℃，进样量为20μL，检测器为 紫外-可见光检测器，检测波长为220nm。实验结果：头孢克洛峰的保留时间为23.742min；头孢克洛峰与头孢克洛δ-3-异构体峰之间的分离度为10.92；头孢克洛峰的拖尾因子为0.96；峰面积小于对照溶液主峰面积0.5倍且大于对照溶液主峰面积0.1倍的杂质峰共有10个，且各杂质含量在0.11%~0.29%之间，总杂的含量为1.76%；对照溶液连续进样7针重复性 测试中，头孢克洛保留时间的RSD为0.099%，峰面积的RSD为0.083%；头孢克洛灵敏 度溶液的信噪比S/N为101.7。 二、背景 头孢克洛化学名为（6R，7R）-7-［（R）-2-氨基-2-苯乙酰氨基］-3-氯-8-氧代-5-硫杂 -1-氮杂双环［4.2.0］辛-2-烯-2-甲酸一水合物，为白色至微黄色粉末或结晶性粉末，微臭；在水中微溶，在甲醇、乙醇或二氯甲烷中几乎不溶。 三、实验过程 1范围 适用于头孢克洛有关物质的测定。 *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 2原理 头孢克洛及其有关物质在220nm处有紫外吸收，使用高效液相色谱法测定。 3试剂与材料 3.1水：符合GB/T 6682的一级水； 3.2磷酸二氢钠：分析纯； 3.3磷酸：色谱纯； 3.4 0.27%磷酸二氢钠溶液（pH=2.5）：称取磷酸二氢钠（3.2）0.27g，加少量水溶解后加 水至100mL，用磷酸（3.3）调节pH值至2.5，摇匀； 3.5流动相A：0.78%磷酸二氢钠溶液（pH=4.0）：称取磷酸二氢钠（3.2）7.8g，加少量 水溶解后加水至1000mL，用磷酸（3.3）调节pH值至4.0，摇匀； 3.6乙腈：色谱纯； 3.7流动相B：乙腈（3.6）-0.78%磷酸二氢钠溶液（pH=4.0）（3.5）=45∶55； 3.8头孢克洛对照品； 3.9头孢克洛δ-3-异构体对照品； 3.10头孢克洛试验用样品。 4仪器与设备 4.1高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温 箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站； 4.2分析天平：精确到0.0001g； 2 *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 4.3涡旋振荡器； 4.4超声波清洗机； 4.5 pH计； 4.6容量瓶：10mL、100mL、1000mL，棕色带刻度。 5测定步骤 5.1溶液配制 系统适用性溶液：取头孢克洛对照品（3.8）和头孢克洛δ-3-异构体对照品（3.9）各适 量，加0.27%磷酸二氢钠溶液（pH=2.5）（3.4）溶解并稀释制成每1mL中各约含25μg和50μg的混合溶液； 供试品溶液：取本品约50mg，置于10mL容量瓶中，加0.27%磷酸二氢钠溶液（pH=2.5）（3.4）溶解并稀释至刻度，摇匀； 对照溶液：精密量取供试品溶液1mL，置于100mL容量瓶中，用0.27%磷酸二氢钠溶 液（pH=2.5）（3.4）稀释至刻度，摇匀； 灵敏度溶液：供试品溶液用0.27%磷酸二氢钠溶液（pH=2.5）（3.4）稀释2000倍。 5.2色谱条件 a）色谱柱：C18色谱柱，4.6×250mm，5μm或者相当的色谱柱； b）以0.78%磷酸二氢钠溶液（3.5）为流动相A，以乙腈（3.6）-0.78%磷酸二氢钠溶液（pH=4.0）（3.5）=45∶55为流动相B（3.7），按照下表进行梯度洗脱： *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%） 0 95 5 30 75 25 45 0 100 50 0 100 51 95 5 61 95 5 c）流速：1.0mL/min； d）柱温：35℃； e）检测器及波长：检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为220nm； f）进样量：20μL。 6系统适用性要求 系统适用性溶液色谱图中，头孢克洛峰的保留时间约为23分钟，头孢克洛峰与头孢克 洛δ-3-异构体峰之间的分离度应不小于2.0，头孢克洛峰的拖尾因子应小于1.2。 7限度 供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍 （0.5%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2倍（2%），小于对照溶液主 峰面积0.1倍的峰忽略不计。 8实验结果 按照上述色谱条件（5.2）进行采集，系统适用性溶液的色谱图如图1所示，积分结果 如表1所示。 *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 图1系统适用性溶液的色谱图 表1系统适用性溶液色谱图积分结果 目标物 保留时间 峰面积 峰高 （mAU.s）（mAU）理论塔板数分离度 对称/拖尾因子 （min） 头孢克洛δ-3-异构体 20.525 1541.583 139.981 79439 - 0.93 头孢克洛 23.742 621.622 55.154 101662 10.92 0.96 由表1中数据可知，头孢克洛峰的保留时间为23.742min，满足《中国药典（2020年 版）二部》中头孢克洛峰的保留时间约为23分钟的要求；头孢克洛峰与头孢克洛δ-3-异构 体峰之间的分离度为10.92，满足《中国药典（2020年版）二部》中头孢克洛峰与头孢克 洛δ-3-异构体峰之间的分离度应不小于2.0的要求；头孢克洛峰的拖尾因子为0.96，满足《中 国药典（2020年版）二部》中头孢克洛峰的拖尾因子应小于1.2的要求。 供试品溶液的色谱图如图2所示，积分结果如表2所示。 *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 时间[min 图2供试品溶液的色谱图 表2供试品溶液色谱图积分结果 目标物 保留时间 峰面积 对照溶液主 单杂含量 总杂含量 （min） （mAU.s） 峰峰面积 （mAU.s） （%） （%） 杂质1 5.108 265.194 0.22 杂质2 6.150 188.655 0.16 杂质3 16.917 350.703 0.29 杂质4 20.508 127.216 0.11 杂质5 21.025 181.781 0.15 头孢克洛 24.450 78932.612 1211.320 - 1.76 杂质6 24.942 132.599 0.11 杂质7 25.550 213.780 0.18 杂质8 28.392 314.589 0.26 杂质9 29.750 161.163 0.13 杂质10 40.442 197.754 0.16 对色谱图中主峰及各个杂质峰进行积分，依据公式（1）计算各杂质的含量。 式中:X----为各杂质的含量,单位为百分数(%); ----为供试品溶液中杂质的峰面积; 对,----为对照溶液中主峰的峰面积; 100----为换算系数。 由表2中数据可知，峰面积小于对照溶液主峰面积0.5倍且大于对照溶液主峰面积0.1倍的杂质峰共有10个，且各杂质含量在0.11%~0.29%之间；总杂的含量为1.76%，不大 于限度2%。 对照溶液的色谱图如图3所示。 图3对照溶液的色谱图 将对照溶液连续进样7针，叠加的色谱图如图4所示，统计结果见表3。 *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 图4对照溶液连续进样7针叠加的色谱图 表3对照溶液连续进样7针重复性数据统计 目标物 项目 1 2 3 4 5 6 7 平均值 RSD% 头孢克洛 保留时间 （min） 23.725 23.742 23.767 23.767 23.775 23.783 23.792 23.764 0.099 峰面积 （mAU.s） 1211.320 1210.567 1211.301 1210.843 1209.976 1209.311 1208.707 1210.289 0.083 由表3中数据可知，对照溶液连续进样7针重复性测试，头孢克洛保留时间的RSD 为0.099%，峰面积的RSD为0.083%，具有良好的定性定量重复性。 灵敏度溶液的色谱图如图5所示，灵敏度计算结果见表4。 图5仪器灵敏度的色谱图 *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 表4头孢克洛灵敏度计算结果 目标物 峰高 （mAU） 噪声 （mAU） S/N 头孢克洛 5.389 0.053 101.7 由表4中数据可知，头孢克洛灵敏度溶液的信噪比S/N为101.7。 9结论 通过对系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液和灵敏度溶液进行测定，实验结果表明：头孢克洛峰的保留时间为23.742min，满足《中国药典（2020年版）二部》中头孢克洛峰 的保留时间约为23分钟的要求；头孢克洛峰与头孢克洛δ-3-异构体峰之间的分离度为10.92，满足《中国药典（2020年版）二部》中头孢克洛峰与头孢克洛δ-3-异构体峰之间的分离度 应不小于2.0的要求；头孢克洛峰的拖尾因子为0.96，满足《中国药典（2020年版）二部》中头孢克洛峰的拖尾因子应小于1.2的要求；峰面积小于对照溶液主峰面积0.5倍且大于对 照溶液主峰面积0.1倍的杂质峰共有10个，且各杂质的含量在0.11%~0.29%之间；总杂的 含量为1.76%，不大于限度2%；对照溶液连续进样7针重复性测试中，头孢克洛保留时间 的RSD为0.099%，峰面积的RSD为0.083%，具有良好的定性定量重复性；头孢克洛灵 敏度溶液的信噪比S/N为101.7。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪对头孢克洛有关 物质的测定，在出峰时间、分离度及拖尾因子等方面均满足《中国药典（2020年版）二部》的要求。 *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。 附1：仪器配置清单 序号 单元 K2025二元高压梯度系统 A) Pump Unit泵单元 1 62MPa二元高压输液泵（内置溶剂托盘） 2 流动相瓶（肖特瓶，1L） 3 脱气机 4 四通道溶剂切换阀 5 自动在线清洗系统 B) Sample Injector进样器 1 自动进样器 2 样品瓶（2mL，含瓶盖） 3 脱气组件 4 100μL定量环C) Column Oven柱温箱 1 色谱柱恒温箱（室温以下10℃至85℃） 2 色谱柱：Kromasil 100-5-C18,，4.6×250mm，5µm D) Detector检测器 1 紫外-可见光检测器 E) Workstation工作站 1 Wookinglab（中文版） *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 附2：悟空Wooking K2025高效液相色谱仪（可靠、精准、友好、合规） 报告人：张佳佳 联系方式：18810812920 *本报告仅供委托方进行科研、产品研发之目的使用。 *本报告有关的检测数据、结果不具有向委托方之外的任何主体、社会公众的证明、验证作用。