赛默飞智能双柱交替在线高通量脱盐液质联用技术用于DNA 引物分析

本文基于赛默飞Vanquish Duo Flex 超高效液相色谱平台针对DNA 引物样品建立了简单、快速的超高效液相色谱线性离子阱质谱仪 （Vanquish Duo-LTQ XL）在线除盐分子量测定分析方法。本文系 列方法对于后续深入开发Vanquish Duo与LTQ XL联用双柱交替高通 量智能分析DNA引物样品具有指导意义。thermoscientific 赛默飞智能双柱交替在线高通量脱盐液质联用技术用于 DNA 引物分析 郑喆 a a 王海燕 b b 曹建明 a a 赛默飞世尔科技（中国）有限公司，北京 11100001 b宝生物工程（大连）有限公司 关键词 在线脱盐，高通量，DNA 引物，液质联用 摘要 本文基于 赛 默飞Vanquish Duo Flex 超高效液相色谱平台针对DNA 引物样品建立了简单、快速的超高效液相色谱线性离子阱质谱仪 L)）在线除盐分子量测定分析方法。本文系 列方法对于后续深入开发Vanquish Duo 与 LTQ XL联用双柱交替高通 量智能分析 DNA 引物样品具有指导意义。 1.引 言 核苷酸包括脱氧核糖核酸及核糖核酸，如用于基因扩增和基因诊断的 PCR 引物和反义核酸,介导基因沉默的小干扰 RNA ( small interfering NA,，siRNA ）等，研究开发基因靶向药物可用于治疗病毒、肿瘤和 遗传疾病。 DNA 引物，是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的，一种具有 特定核苷酸序列的大分子，与反应物以氢键形式连接，这样的分子 称为 DNA 引物。DNA 引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一 个引物与靶区域一端的一条 DNA 模板链互补，另一个引物与靶区域 另一端的另一条 DNA 模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的 起始点，核酸聚合酶可由其 3’端开始合成新的核酸链。体外人工 设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。但合成 的 DNA 引物含有各种杂质，需纯化精制，产物的鉴定和产品的质量 控制至关重要。 液相和液质联用于 DNA 引物的高分辨分离和鉴定。DNA 引物样品中 存在的盐分会影响其离子化过程和造成峰强度降低，因此有必要进 行质谱鉴定前的除盐处理。常规离线除盐方法耗时；可以利用在线 除盐方式进行 DNA 引物的分离鉴定，以满足高通量的要求 。。。 2.实验部分 2.1仪器 ThermoFisher Vanquish Duo Flex 与 LTQ XL 超高效液相色谱离子阱 质谱联用系统包括： 泵: Dual Pump (P/NVF-P32-A) 自 动进样器: Split Sampler FT (P/NVF-A10-A) 柱温箱: Column Compartment H(P/NVH-C10-A) 管线和阀: Vanquish Duo串联管线套件(P/N 6036.2020)质谱仪: Thermo ScientiycT M LTQ XL质谱 软件: Chromeleon CDS 7.2 SIl和Xcalibur T M 色谱柱 : DNAPacTM RP (P/N 088925) 2.2化合物信息及试剂 合成的不同分子量的 DNA 引物含盐的样品来源于客户。甲醇(质谱级, Fisher 公司) N,N-二异丙基乙 胺 (DIEA) (Sigma品牌) 六氟异丙醇苯胺 (HFIPA) ( Sigma品牌)去离子水(18.2M°) 2.3色谱质谱条件和特殊软件参数设置 2.3.1色谱条件 色谱柱: DNAPac T M RP (2.1x10 mm 4um) 柱温:40℃ 进样量:1pL; 流动相: A: 0.5%HFIPA和0.05% DIEA的水溶液 B: 10%的A+90%甲醇溶液 表 1.右泵平衡泵梯度方法 时间 流速(mL/min) B% 0 0.75 100 0.50 0.75 100 0.51 0.75 0 1.00 0.75 0 表 2.左泵分析泵梯度方法 时间 流速(mL/min) B% 0.2 0.75 0 0.21 0.75 100 0.40 0.75 100 0.41 0.75 0 1.00 0.75 0 2.3.2质谱条件 质谱阀位:0.00~0.55min到废液,0.55~1.00min进质谱 表 3.质谱条件 离子源参数 Sheath Gas Flow Rate 40 Aux Gas Flow Rate 10 Sweep Gas Flow Rate 0.01 Spray Voltage 3.0kv Capillary Temp 275 Capillary Voltage -20 Tube Lens -120 SID 45 Scan Mode ITMS-CESI Full ms 210-2000 2.3.3特殊软件参数设置 图 1.双柱交替分析与平衡智能流路功能软件设置 表 4.自定义阀切换脚本命令 时间 命令 0.19min SamplerModule.Sampler.SwitchValve Position=Bypass 该进样阀切换命令，可以将进样针和样品环从当前流路中屏蔽出 来，等待执行预进样命令。 在液相方法脚本中插入如表 5里的命令： 表 5.自定义预进样脚本命令 时间 命令 SamplerModule.Sampler. 0.32min PrepareNextInjection 该命令，可以在当前方法结束之前，提前进行取样动作（甚至可包 含进样前、后洗针动作），实验方法不占用任何取样洗针时间，缩 短整个分析周期，提高样品分析通量。 在液相方法脚本中插入如表 6里的命令： 表 6.自定义切换色谱柱命令 时间 命令 1.00min ColumnComp.NextColumn 该命令，可以在当前方法结束之时，自动将分析流路中的色谱柱切 换为另一根。 3.实验过程与结果 3.1双柱交替在线除盐过程描述门 利用图2的Vanquish Duo双柱交替在线除盐流路图,可以加速目标 化合物脱盐和分析以及色谱柱再平衡的过程。在线除盐和分析的整 个过程主要分为两个部分： （阀 1-2位）样品通过左泵即分析泵上样至柱 A ，在表 2梯度条件 下，样品中的盐被快速去除，待测样品保留在柱 A 上，质谱流路至 废液；0.55min 后质谱流路至质量分析器，有机相将目标物洗脱进 质谱分析。与此同时，右泵即平衡泵，正在用高有机相对柱 B 进行 活化再生和高水相平衡，等待下一次使用柱 B 做分析。 （阀 6-1位）样品通过左泵即分析泵上样至柱 B ，类似于阀 1-2位时 柱 A 的使用情况，对柱 B 上目标化合物进行脱盐和洗脱进入质谱分 析，与此同时，右泵即平衡泵，正在用高有机相对柱 A 进行活化再 生和高水相平衡，等待下一次使用柱 A 做分析。 总而言之，当柱 A 正在做脱盐和分析时，与此同时，柱 B 正在活化 再生和平衡等待进样。然后双柱角色互换，如此循环往复。 图 2.智能双柱交替流路连接示意图 3.2 Vanquish Duo Flex MS (LTQ XL)双柱交替在线除盐进行DNA 引物定性分析 图 3-10所示，为 DNA 引物样品的 8张质谱总离子流图。响应良好，测 得质谱原始数据须保存为RAW 格式,通过Xcalibur软件Promass分析 进行去卷积分析，得到相应的 DNA 引物样品分子量（图 11-18）和 去卷积后谱图（图 19-26）。表 7为 DNA 引物实测结果与理论数值对 比。 图3. XGAMC-5074~24的TIC总 离 子流图 图 4. XGAMC-5074~25的TIC总 离 子流图 图5. CJMG274-01~Y的TIC总离子流图 图6. XGAMC -5088~Y的TIC总离子流图 图7.KFMB-4075的 T IC总离子流图 图8. XGAMC-5093Y1的TIC总离子流图 图11.XGAMC -5074~24的原始质谱图 图 9. XGAMC-5093Y2的 T IC总离子流图 图12.XGAMC-5074~25的原始质谱图 图10. CJMG316-01Y的TIC总离子流图 图13. CJMG274-01~Y的 原 始质谱图 图14. XGAMC-5088~Y的 原 始质谱图 图17. XGAMC-5093Y2的原始质谱图 图15.KFMB-4075的原始质 谱 图 图18. CJMG316-01Y的原始质谱图 图16. XGAMC-5093Y1的原始质谱图 图19.XGAMC-5074~24的去卷积放大谱图 图20. XGAMC-5074~25的去 卷 积放大谱图 图23. KFMB-4075的去卷积放大谱图 图21. CJMG274-01~Y的去卷积放大谱图 图24. XGAMC -5093Y1的去卷积放大谱图 图22. XGAMC-5088~Y的去卷积放大谱图 图25. XGAMC-5093Y2的去卷积放大谱图 图26. CJMG316-01Y的去卷积放大谱 图 图27.进样间隔1min序列截图 表 7.理论分子量与实测分子量对比 Sanple ID Vial RT (min) TargetIass(Da) ObservedIass(Da) DeltaIass,Obs 一Target (Da) %PurityEstinate PresunedIdentity ResultCode TargetMass Intensit XGAMC-5074~24 2 0.798 8394.9 8394.1 -0.8 100 Target Mass 1.11E+06 1.62E+06 XGAMC-5074 25CJMG274-01YXGAMC-5088Y 345 0.7660.7440.741 8394.98456.8 8394.2 8457.2 -0.7 0.4 100 100100100 Target Mass Target MassTarget MassTarget Mass KFMB-4075XGAMC-5093Y1 67 3.03E+062.25E+06 0.7470.747 8680.310619.7 8981.5 0.4 0.0 -4.3 0 Not Found XGAMC-5093Y2 8 0.753 8985.8 8981.7 -4.1 0 Not Found 0 CJMG316-01Y 9 0.705 8799.1 8799.4 0.3 100 Target Mass 3.71E+06 0.741 8679.9 2.25E+06 10619.7 100 Target Mass 2.14E+06 8985.8 0 4.讨论与结论 4.1从图 27序列中每一针进样时间间隔可知，该方法分析周期实为 1min （含进样、取样前洗针、取样后洗针、脱盐、分析、采集质谱数据）。因受限于该 DNAPac 色谱柱压力上限，无法将流速进一步提升，同时低压梯度泵延迟体积较大，也限制了分析周期的进一步缩短。故若采用 C18色谱柱作为脱盐柱，结合二元高压梯度泵，则分析周期可以进一步缩短。 4.2本法无需单独为柱 A 和柱 B 分别建立方法，全程只有一个方法，真正实现智能双柱交替在线除盐。 4.3从 DNA 引物去卷积后质谱图（图 19-26）可见，8个化合物主峰周围都非常干净，无加钠加钾峰，说明脱盐效果非常理想，排除了样 品中盐对质谱信号的干扰，达成脱盐目标。而且是双柱交替脱盐，说明每根色谱柱都能够很好的实现脱盐、分析、活化再生和平衡，确 保分析的稳定性、可靠性。 4.4从表 7中 DNA 引物的较高质谱信号强度可知，低流速分析在节省试剂的同时，没有牺牲质谱的信号响应，故该法兼顾了低分析成本、高分析通量和高质谱信号响应。 4.5从表 7中 DNA 引物分子量理论与实测值比较可知，偏差在 0~100ppm 之间，化合物匹配失败的除外。 本文基于Vanquish Duo Flex与LTQ XL质谱联用平台,成功实现了智能双柱交替在线高通 量 脱盐用于DNA引物分析,对于后续深入开发该 技术具有指导意义。 参考文献 1.杨艳,程汉兴,刘晓达,金燕.在线脱盐高通量液质联用分析寡核苷酸。AN_19044_HPLC 热线 8008105118电话 400 6505118www.thermofisher.com