奶酪中蛋白质、氨基酸水解检测方案(微波消解仪)

Application NotePage 1 of 3ap0235v1Microwave-Assisted Amino Acid Hydrolysis of Cheese 奶酪的微波辅助氨基酸水解 奶酪的成熟涉及多种生化变化，例如脂肪水解、乳糖发酵和蛋白质降解。这些过程极大地影响了奶酪的质地、味道和香气。更具体地说，氨基酸的含量和特性会影响整个老化过程的奶酪风味。1食物中的氨基酸既是游离的未结合分子，也是通过肽键结合在一起的氨基酸残基，从而产生乳制品中存在的各种蛋白质。为了全面评估奶酪在整个成熟过程中的氨基酸含量，需要对氨基酸组成进行准确评估。为此，必须水解蛋白质，有效地释放氨基酸残基，然后可以在水解产物中对其进行定量检测。 材料与方法试剂与样品 所有试剂均购自商业供应商，水解溶液在使用前新鲜制备。从当地的商店收集奶酪样品，在食品加工机中均质化，并在4℃下储存直至分析。使用分析天平等分每个样品的300mg部分，用于其指定的水解反应。水解产物的氨基酸含量通过柱前衍生化，然后进行 UPLC进样和260 nm 处的 PDA检测来确定。。Waters AccQ-TagTM Ultra Derivatization 试剂盒用于水解产物的LC-PDA分析。所有样品一式三份进行分析。 传统的氨基酸水解方法 传统上，蛋白质在酸性或碱性条件下分别用6NHC或4NNaOH在密封在玻璃小瓶中加入300 mg样品，然后加入2.5 mL含容器中110C处理18至24小时进行化学水解，时间、温度和3%(w/v)苯酚溶液的6NHCI。然后用N2吹扫反应试剂等因素会影响水解反应的准确性和精密度，从而影响氨基酸瓶并迅速密封。重复此过程，直到所有样品都准备好定量。总之，氨基酸分析是一项昂贵、棘手且耗时的实验室程序。放入110℃烘箱中20小时。完成后，将样品从烘箱通常，水解反应代表着这个过程的反应中速度受到限制；取出并在衍生前冷却至室温。 减少有机反应的反应时间，另一种方法是用微波能代替常规加热。. Discover 2.0水解方法 与传统的加热方法相比，微波可以在更高的温度和更短的反应时反应设置：将300mg样品部分添加到配备有搅拌棒的间内成功地促进蛋白质水解反应。 3 CEM 的 DiscoverQ 2.0微35-mL Pyrex容器中。然后向每个微波反应容器中加波反应器可以为实验室提供工具，以高效、可重复和安全的方式。入体积为5 mL 的6 N HClw/3%苯酚。 容器用 N2吹扫5分分，用 TeflonQ 内衬硅胶盖快速密封，然后放置在自动进样器架中，以便自动放置在 Discover 2.0腔中。方法编程： 一步动态法，在 Discover2.0系统中为奶酪的氨基酸水解编程。 使用以下的方法参数： 酸水解 容器类型； Pyrex控制方式： Dynamic动态 温度：165℃ 时间：20-min 压力：300 PSI 概率：300W 搅拌：高 分析的样品准备 所有水解产物溶液通过 0.2 um PTFE 过滤器并用6MNaOH 中和， 为 AccQ-Tag 衍生化做准备。将来自Waters AccQ-Tag Ultra Derivatization 试剂盒的 70uL硼酸盐缓冲液添加到新的回收瓶中。加入10uL中和样品，将小瓶盖上盖子并涡旋。然后，将20 uL 从试剂盒中制备的衍生化试剂添加到每个样品反应中。将反应混合物涡旋10秒，然后在55℃下加热10分钟，然后进行分析。 分析 将5 uL体积的每个衍生反应注入与 Waters PDA 检测器相连的 Waters Acquity H-Class UPLC。使用Waters AccQ-Tag Ultra C18色谱柱(1.7 um， 2.1x100 mm) 以0.25 mL/min 的流速进行分离。柱温为45℃。洗脱梯度如表1所示。流动相为A： 在MilliQ水中稀释10倍的 Waters AccQ-Tag Eluent A 和 B：Waters AccQ-Tag Eluent B。为了确定每种氨基酸的氨基酸浓度， Waters Amino酸标准(沃特世公司，部件号WAT088122) 是在5、10、25、50和100pmol/uL 的浓度下衍生。 Table1.用于衍生氨基酸分离的梯度 Time (min) Flow(mL/min) %A %B Initial 0.250 99.9 0.1 0.50 0.250 99.9 0.1 28.00 0.250 90.0 10.0 32.00 0.250 75.0 25.0 34.00 0.250 0.0 100.0 36.00 0.250 0.0 100.0 36.01 0.250 99.9 0.1 40.00 0.250 99.9 0.1 结果与讨论 Discover 2.0经评估可促进奶酪的酸辅助氨基酸水解。将结果与对相同样品进行的传统烘箱水解方法进行了比较。表2重点介绍了在传统水解烘箱条件以及Discover 2.0酸水解反应条件下切达干酪和科尔比干酪样品的氨基酸回收率。所有 Discover 2.0辅助水解反应在回收率方面都与传统水解反应的对应物相比很好。 微波加热提供快速、高效和可靠的整体加热。这种介电加热机制允许以均匀和瞬时的方式将热量传递给反应内容物。传统的加热方法，例如烤箱和加热罩，依赖于通过容器壁传递热量，热量然后再通过反应组分，这导致缓慢和低效的加热以及不希望的温度梯度和副反应。此外，在Discover 2.0 水解反应过程中添加搅拌可提高反应均匀性。最后，压缩空气可将微波辅助反应快速冷却至安全处理温度，从而缩短样品分析时间。 Discover 2.0提供了一种氨基酸水解的替代途径，具有关键优势，包括更短的反应时间、更清洁的水解产物和更快的分析时间 Table 2奶酪中15种氨基酸的回收率 Amino Acid Cheddar Colby Asp + Asn 130.95% 92.12% Ser 103.51% 131.51% Glu + Gln 130.45% 92.37% Pro 121.72% 116.10% Gly 106.10% 106.72% Ala 114.38% 112.27% Val 113.87% 108.77% lle 114.35% 114.09% Leu 105.31% 105.66% Tyr 92.63% 75.48% Phe 103.65% 106.96% Lys 126.55% 101.21% His 107.47% 100.98% 结论 对两种不同的奶酪样品进行酸水解，然后对所得氨基酸进行衍生和表征，以确定完整的氨基酸谱。传统加热法与快速微波法的比较表明，氨基酸的回收率相当，或者在大多数情况下，氨基酸的回收率更高，反应时间更少。 这些结果表明， discover2.0系统可以作为更快速，更安全的监控替代方案贯穿奶酪的生产过程；提供更加深入的熟化，风味概况的监控。 References ( 1 Davidson，I. Methods Mol. Biol. 2003， 211， 111-22. ) ( 2Han， K . ； Richard， C.； Biserte， G. Int. J . Biol. Chem. 1983， 1 5， 875-884. ) 3 Chen， S. T.； Chiou， S. H.；Chu， Y. H.； Wang， K. T. Int. J. Pept.Protein Res.1987，30，572-576. 4Margolis， S. A.； Jassie， L.； Kingston， H. M.J. Automat.Chem.1991， 13，93-95. AccQ-TagTM is a trademark of Waters Corporation.TeflonQ is a registered trademark and a brand name owned by Chemours (formally DuPont). United States France Ireland (Headquarters) 33 (01) 69 35 57 80 800-726-3331 info.fr@cem.com 704-821-7015 ( Germany， Austria， Switzerland (4 9) 2842-9644 -0 in f o@cem. d e ) info@cem.com Italy Japan ◎2022 CEM Corporation (39) 35-896224 +81-3-5793-8542 (44)1280-822873 All rights reserved. This may not be info.srl@cem.com info@cemjapan.co.jp info.uk@cem.com reproduced or published without written permission from CEM. @ CEM Corporation ◎ CEM Corporation 简介奶酪的成熟涉及多种生化变化，例如脂肪水解、乳糖发酵和蛋白质降解。这些过程极大地影响了奶酪的质地、味道和香气。更具体地说，氨基酸的含量和特性会影响整个老化过程的奶酪风味。食物中的氨基酸既是游离的未结合分子，也是通过肽键结合在一起的氨基酸残基，从而产生乳制品中存在的各种蛋白质。为了全面评估奶酪在整个成熟过程中的氨基酸含量，需要对氨基酸组成进行准确评估。为此，必须水解蛋白质，有效地释放氨基酸残基，然后可以在水解产物中对其进行定量检测。传统上，蛋白质在酸性或碱性条件下分别用 6 N HCl 或 4 N NaOH 在密封容器中 110 °C 处理18至24小时进行化学水解，时间、温度和试剂等因素会影响水解反应的准确性和精密度，从而影响氨基酸定量。总之，氨基酸分析是一项昂贵、棘手且耗时的实验室程序。通常，水解反应代表着这个过程的反应速度受到限制；减少有机反应的反应时间，另一种方法是用微波能代替常规加热。与传统的加热方法相比，微波可以在更高的温度和更短的反应时间内成功地促进蛋白质水解反应。CEM 的 Discover® 2.0 微 波反应器可以为实验室提供工具，以高效、可重复和安全的方式。材料与方法试剂与样品所有试剂均购自商业供应商，水解溶液在使用前新鲜制备。从当地的商店收集奶酪样品，在食品加工机中均质化，并在 4°C 下储存直至分析。使用分析天平等分每个样品的 300mg 部分，用于其指定的水解反应。水解产物的氨基酸含量通过柱前衍生化，然后进行 UPLC 进样和 260nm处的 PDA 检测来确定。Waters AccQ-Tag™ Ultra Derivatization 试剂盒用于水解产物的 LC- PDA 分析。所有样品一式三份进行分析。传统的氨基酸水解方法在玻璃小瓶中加入 300mg 样品，然后加入 2.5mL 含 3% (w/v) 苯酚溶液的 6 N HCl。然后用 N 2 吹扫反应瓶并迅速密封。重复此过程，直到所有样品都准备好放入 110°C 烘箱中20小时。完成后，将样品从烘箱中取出并在衍生前冷却至室温。Discover 2.0 水解方法反应设置：将 300mg 样品部分添加到配备有搅拌棒的 35-mL Pyrex 容器中。然后向每个微波反应容器中加入体积为 5mL 的 6 N HCl w/3% 苯酚。容器用 N2 吹扫5分钟，用 Teflon® 内衬硅胶盖快速密封，然后放置在自动进样器架中，以便自动放置在 Discover 2.0 腔中。 方法编程：一步动态法，在 Discover2.0 系统中为奶酪的氨基酸水解编程。 使用以下的方法参数： 酸水解容器类型：Pyrex控制方式: Dynamic动态 温度: 165 °C 时间：20-min压力: 300 PSI 功率: 300 W 搅拌: 高分析样品准备所有水解产物溶液通过 0.2µm PTFE 过滤器并用 6 M NaOH 中和，为 AccQ-Tag 衍生化做准备。将来自 Waters AccQ-Tag Ultra Derivatization 试剂盒的 70µL 硼酸盐缓冲液添加到新的回收瓶中。加入 10µL 中和样品，将小瓶盖上盖子并涡旋。然后，将 20µL 从 试剂盒中制备的衍生化试剂添加到每个样品反应中。将反应混合物涡旋10秒，然后在 55 °C 下加热10分钟，然后进行分析。分析将 5µL 体积的每个衍生反应注入与 Waters PDA 检测 器相连的Waters Acquity H-Class UPLC。使用 Waters AccQ-Tag Ultra C18 色谱柱（1.7µm，2.1 x 100mm）以 0.25mL/min 的流速进行分离。柱温为 45°C。洗脱梯度如表1所示。流动相为A：在 MilliQ 水中稀释10倍的 Waters AccQ-Tag Eluent A 和 B：Waters AccQ-Tag Eluent B。为了确定每种氨基酸的氨基酸浓度，Waters Amino 酸标准（沃特世公司，部件号 WAT088122）是在 5、10、25、50 和 100pmol/µL 的浓度下衍生。结果与讨论Discover 2.0 经评估可促进奶酪的酸辅助氨基酸水解。将结果与对相同样品进行的传统烘箱水解方法进行了比 较。表2重点介绍了在传统水解烘箱条件以及 Discover 2.0 酸水解反应条件下切达干酪和科尔比干酪样品的氨基酸回收率。所有 Discover 2.0 辅助水解反应在回收率方面都与传统水解反应的对应物相比很好。微波加热提供快速、高效和可靠的整体加热。这种介电加热机制允许以均匀和瞬时的方式将热量传递给反应内容物。传统的加热方法，例如烤箱和加热罩，依赖于通过容器壁传递热量，热量然后再通过反应组分，这导致缓慢和低效的加热以及不希望的温度梯度和副反应。此外，在 Discover 2.0 水解反应过程中添加搅拌可提高反应均匀性。压缩空气可将微波辅助反应快速冷却至安全处理温度，从而缩短样品分析时间。Discover 2.0 提供了一种氨基酸水解的替代途径，具有关键优势，包括更短的反应时间、更清洁的水解产物和更快的分析时间。结论对两种不同的奶酪样品进行酸水解，然后对所得氨基酸进行衍生和表征，以确定完整的氨基酸谱。传统加热法与快速微波法的比较表明，在大多数情况下，微波氨基酸的回收率更高，反应时间更少。这些结果表明，Discover2.0 系统可以作为更快速，更安全的监控替代方案贯穿奶酪的生产过程；提供更加深入的熟化，风味概况的监控。参考文献AccQ-Tag™ is a trademark of Waters Corporation. Teflon®isa registered trademark and a brand name owned by Chemours (formally DuPont). Chen, S. T.; Chiou, S. H.; Chu, Y. H.; Wang, K. T. Int. J. Pept. Protein Res. 1987, 30, 572-576. Davidson, I. Methods Mol. Biol. 2003, 211, 111-22. Han, K.; Richard, C.; Biserte, G. Int. J. Biol. Chem. 1983, 15, 875-884. Margolis, S. A.; Jassie, L.; Kingston, H. M. J. Automat. Chem. 1991, 13, 93-95.