二甲双胍中N-亚硝基二甲胺检测方案(液相色谱仪)

thermoscientific 离子源参数热线8008105118电话 400 6505118www.thermofisher.com仅用于研究目的。不可用于诊断目的。 ◎2020 Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。所有商标均为Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除非另有指明。 全新一代三重四极杆质谱仪TSQ Fortis检测二甲双胍中的N-亚硝基二甲胺 王立杰、高鹏、郭藤，赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词： 二甲双胍 N-亚硝基二甲胺TSQ Fortis 针对二甲双胍中的基因毒性杂质N-亚硝基二甲胺，基于赛默飞液相色谱串联三重四极杆质谱TSQ Fortis建立了稳定灵敏的分析方法。该方法使用大气压化学电离源(APCI)进行有效检测分析，在适宜的浓度范围内线性关系良好(r2>0.99)。2ng/mL浓度水平重复性试验结果优异。该方法稳定快速，灵敏度能满足二甲双胍中微量基因毒性物质N-亚硝基二甲胺的日常分析要求。 二甲双胍为首选用单纯饮食控制及体育锻炼治疗无效的2型糖尿病，特别是肥胖的2型糖尿病，且与胰岛素合用，可减少胰岛素用量，防止低血糖发生、与磺酰脲类降血糖药合用，具协同作用。N-亚硝基二甲胺等基因毒性杂质是指化合物本身直接或间接损伤细胞DNA，产生致突变和致癌的物质。特点是在很低的浓度时即可造成人体遗传物质的损伤，进而导致基因突变并可能促使肿瘤发生。因其毒性较强，对用药的安全性产生了强烈的威胁。 已上市药品中发现痕量的基因毒性杂质残留而被召回的案例，时有发生，给药厂造成了巨大的经济损失。近期，据报道美国FDA正在检测二甲双胍中可能含有的致癌物。新加坡、欧洲药品监管部门也已经对二甲双胍中NDMA的含量进行了检测。新加坡卫生科学管理局宣布二甲双胍中NDMA可能高于“国际可接受水平”后，已经召回了在新加坡销售的46种二甲双胍药品中的3种。欧洲药品管理局(EMA)也表示，正在对二甲双胍样本进行NDMA检测， EMA在一份声明中表示： “尽管目前为止发现的NDMA风险非常低，但药物中应避免NDMA等杂质，如果发现NDMA水平高于一定要求，有关部门将采取必要行动”。 基于上述检测需要，本文建立了基于Thermo Fisher Scientific TSQFortis三重四极杆串联质谱仪分析二甲双胍中的N-亚硝基二甲胺的高灵敏度检测方法，定量限为1ng/mL。本方法重现性好，线性范围宽，适于进行二甲双胍中N-亚硝基二甲胺的日常分析检测。 1.实验部分 1.1仪器与试剂 1.1.1 Thermo Fisher Vanquish Binary Flex超高效液相色谱仪1.1.2Thermo Fisher TSQ Fortis三重四极杆质谱仪 1.1.33Thermo Scientific Hypersil GOLD Phenyl色谱柱(P/N： 25903-104630) 1.1.4甲醇， LCMS级 (Fisher A456-4) 1.1.5乙腈， LCMS级(Fisher A955-4) 1.1.6水， LCMS级(Fisher W6-4) 1.1.7甲酸， LCMS级(Fisher A117-50) 1.1.8 Titan3， 17mmPVDF过滤器，0.22um(P/N： 42213-PV) 1.2样品前处理 1.2.1NDMA标准品储备液 N-亚硝基二甲胺标准品，纯度98.5% 化合物 英文名称 英文简写 CAS 分子式 分子量 名称 N-亚硝基 N-Nitrosodi-NDMA 62-75-9 C2H- 74.05 二甲胺 methyamine 6N2O 用超纯水配置NDMA标准品溶液，并用水稀释至100 ng/mL作为标准品储备液 1.2.2灵敏度溶液 精密量取对照品溶液适量，定量稀释制成每1mL中含1ng的溶液。 1.2.3供试品溶液制备 取本品药片(或胶囊)细粉适量，精密称定，至50mL离心管中，精密加入甲醇10mL， 涡旋混匀1 min， 震荡20 min，以4500转/分的速率离心10分钟，取上清液滤过，取续滤液即得。 1.3色谱条件 本实验中采用Thermo Scientific Hypersil GOLD Phenyl HPLC分析柱，高载量，峰型好，对NDMA有较好的保留，和API可以做到有效分离。该分析柱基于高纯硅胶设计，用于解决诸多色谱难题，包含C4连接基团，具备中等疏水性，与芳香族化合物具有加强的 pi-pi相互作用，具有出众的峰形和灵敏度，特别适合苯环和芳环化合物的分析，对芳环分析物具有出众的保留能力和独特的选择性。 色谱条件 Flow Rate 0.6 mL/min Mobile Phase A 0.1% formic acid in water Mobile Phase B 0.1% formic acid in methanol Gradient Time(min) A% B% 0.0 95 5 1.0 95 5 3.0 80 20 7.0 100 9.0 100 9.1 95 5 14.0 95 5 Injection Volume 10 ul Autosampler Temp. 8 C Needle Wash 80：20， Methanol： Water with 0.1%Formic 表1色谱条件 1.4质谱条件 本实验采用全新一代Thermo Scientific TSQ Fortis三重四极杆质谱仪，该质谱仪具备卓越的耐用性，通过主动离子管控技术(AIM+)和基质分离离子引导(MSIG)保持离子路径清洁，确保系统更长时间正常运行；配合多款液相色谱实现日常高通量定量分析。 Ion Source APCI+ Sheath Gas Flow Rate 50 arbitrary units Aux Gas Flow Rate 10 arbitrary units Sweep Gas Flow Rate 0 units Spray Current 5 uA Capillary Temp. 300℃ Aux Gas Heater Temp. 300℃ 表2质谱条件 Compound Precursor Product CE RF Lens (m/z) (m/z) (V) (V) NDMA 75.0 43.071 16.16 56 58.071* 12.58 56 表3离子对信息(*表示定量离子对) 2实验结果 2.1结果谱图 图1空白水、LOQ溶液色谱图 采用上述仪器条件，在LOQ浓度条件下， NDMA可得到良好峰型，满足FDA(FY20-006-DPA-S)灵敏度要求。 2.2线性范围及系统适应性测试 配制浓度为1、2、5、10、50、100 ng/mL的标准溶液，采用上述仪器条件进行检测，所得标准曲线线性关系良好，相关系数R2大于0.99。按照FDA法规进样顺序要求，序列中初始6针标准品溶液(2ng/mL)相对标准偏差为6.01%，整个序列中标准品溶液偏差小于5%。原料药样品中NDMA的保留时间与标准品偏差小于2%，经测定原料药样品中NDMA的浓度为1.8 ng/mL。 图2NDMA线性关系 Metormin_2 5.00e2 RT=3.77 min 45e24.0e23.5e23.0e22.5e22.0e2 1.5e2 10e2 RT=3.79 min 4.75e2450e2425e2-4.00e2-375e2-350e2325e2-300e2-275e2-2.50e2225e2：200e2-1.75e2- 150e2- Metformin_2 5.00e2： T=3.80 W 475e2450e2425e2-4.00e2：13.75e23.6002325e2-300e22.75e2-2.50e2：225e2：2.00e2-1.75e2- 150e2 图3浓度为2 ng/mL重现性图谱 进样顺序 峰面积 保留时间 (min) Blank-1 一 一 Blank-2 一 - Standard-1 3273 3.77 Standard-2 3729 3.79 Standard-3 3266 3.80 Standard-4 3352 3.79 Standard-5 3580 3.79 Standard-6 3685 3.79 Blank-3 一 Sample-1 3420 3.79 Standard 3764 3.80 mm m 表4进样顺序及结果 图4实际样品中NDMA检测色谱图(样品图谱中3min前与6min后切入废液) 结论 本文建立了基于三重四极杆质谱TSQ Fortis检测二甲双胍中基因毒性杂质N-亚硝基二甲胺(NDMA)的方法，该方法的灵敏度及重现性完全可以满足FDA要求；实际样品检测时NDMA可与主成分有效分离，保证结果准确性。同时，针对制药行业仪器控制及数据处理软件合规性要求，所有数据完全采用符合法规要求的Chromeleon软件进行处理，从而可为用户提供NDMA检测的完整解决方案。 ( 参考文献 ) 1. FY20-006-DPA-S_Liquid Chromatography-Tandem MassSpectrometry (LC-MS/MS) Method for the Determination ofNDMA in Ranitidine Drug Substance and Solid Dosage DrugProduct (https：//www.fda.gov/media/131868/download) 2.FY19-177-DPA-S_ Liquid Chromatography-High ResolutionMass Spectrometry (LC-HRMS) Method for the Determinati-on of NDMA in Ranitidine Drug Substance and Drug Product(https：//www.fda.gov/media/130801/download) 2.1 结果谱图图1 空白水、LOQ溶液色谱图采用上述仪器条件，在LOQ浓度条件下，NDMA可得到良好峰型，满足FDA（FY20-006-DPA-S）灵敏度要求。2.2 线性范围及系统适应性测试配制浓度为1、2、5、10、50、100 ng/mL的标准溶液，采用上述仪器条件进行检测，所得标准曲线线性关系良好，相关系数R2 大于0.99。按照FDA法规进样顺序要求，序列中初始6针标准品溶液（2 ng/mL）相对标准偏差为6.01%，整个序列中标准品溶液偏差小于5%。原料药样品中NDMA的保留时间与标准品偏差小于2%，经测定原料药样品中NDMA的浓度为1.8 ng/mL。