氨基酸中在线针内衍生紫外检测和非衍生电雾式检测方案(液相色谱仪)

thermoscientific 表2色谱条件 热线800 8105118电话4006505118www.thermofisher.com仅用于研究目的。不可用于诊断目的。 ◎2020 Thermo Fisher Scientific Inc.保留所有权利。所有商标均为 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除非另有指明。 全新Vanquish Core高效液相色谱系统用于氨基酸分析——在线针内衍生紫外检测和非衍生电雾式检测方法比较 沈国滨，金燕赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 关键词：氨基酸，在线针内衍生，非衍生法，电雾式检测，石墨化碳柱 氨基酸是构成人体所需蛋白质的基本物质，是一类含有氨基和羧基的有机化合物。大部分氨基酸通常紫外吸收较弱，直接使用紫外方法检测干扰较大，灵敏度低。故通常需要通过合适的衍生试剂经衍生化增加生色团后，再使用紫外检测以提高其检测灵敏度。目前用于氨基酸衍生化反应的方法和试剂很多，主要分为柱前和柱后衍生，柱前衍生又有离线和在线衍生。衍生化试剂主要有异硫氰酸苯酯(PITC)、氨基甲酸酯(AQC)、邻苯二甲醛(OPA)、芴甲基氯甲酸甲酯(FMOC)和二硝基氟苯(DNFB)等I1-3]，不同的衍生化试剂在反应原理、效率及稳定性等方面不尽相同。最新公布的2020版中国药典(二部)，根据氨基酸种类、浓度等方面的差异，收录了多个用于补充营养的平衡型复方氨基酸注射液制剂品种，如18AA，，18AA-I~18AA-IV。其中就收录了异硫氰酸苯酯-柱前衍生-紫外检测法用于氨基酸含量测定4。 除了通过衍生法分析氨基酸的方法外，结合赛默飞特有的石墨化碳柱-—Hypercarb色谱柱和特色的通用型检测器-—电雾式检测器(Charged Aerosol Detector， CAD)，无需衍生即可实现对氨基酸的直接检测③。本文在赛默飞全新Van-quish Core液相色谱平台上，开发了基于传统OPA/FMOC衍生化试剂组合的在线针内衍生紫外检测方法，并与Hypercarb-CAD非衍生直接检测方法比较，对比两种方法在分析复方氨基酸注射液上的性能差异。 2.1 仪器与试剂 2.1.1 Thermo Fisher Vanquish Core高效液相色谱仪泵： Quaternary Pump C (VC-P20-A) . 自动进样器： Split Sampler CT(VC-A12-A， 100pL定量环)。 柱温箱： Column Compartment C(VC-C10-A)。 检测器： Variable Wavelength Detector C (VC-D40-A，含13uL流通池)， Vanquish Char-ged Aerosol Detector H (VH-D20-A)。 色谱软件：变色龙Chromeleon 7.3。 2.1.2试剂：乙腈、日甲醇(色谱级，Fisher公司)，去离子水(18.2MQ，Millipore纯水机)，邻苯二甲醛(o-phthaldialdehyde，OPA)、3-巯基丙酸(3-mer-capto-propionic acid， MPA)、芴甲基氯甲酸甲酯(9-fluorenylmethoxycarbonyl chloride， FMOC)、九氟戊酸(Perfluoropentanoic acid， PFPA)和磷酸均为色谱级，购自Sigma-Aldrich公司，磷酸氢二钾、四硼酸钠十水化合物和氢氧化钠均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。 2.1.3 1 标准品：17种氨基酸混标H型标准品购自FUJI-FILM Wako公司，浓度为2.5umol/mL(溶解于0.1mol/L HCI溶液中)，其中包含的17种氨基酸如下：天门冬氨酸(L-Aspartic Acid， Asp)、谷氨酸(L-Glutamic Acid， Glu)、丝氨酸(L-Serine， Ser)、组氨酸(L-Histidine， His)、甘氨酸(Glycine， Gly)、苏氨酸(L-Threonine， Thr)、精氨酸(L-Arginine，Arg)、丙氨酸(L-Alanine， Ala)、胱氨酸(L(-)-Cystine， Cys-Cys)、酪氨酸(L-Tyrosine， Tyr)、缬氨酸(L-Valine， Val)、甲硫氨酸(L-Methionine，Met)、苯丙氨酸(L-Phenylalanine， Phe)、异亮氨酸(L-Isoleucine， lle)、亮氨酸(L-Leucine，Leu)、赖氨酸(L-Lysine， Lys)和脯氨酸(L(-)-Proline， Pro)。 2.2试剂制备 2.2.1衍生试剂制备：各衍生试剂及其制备方法见表1。 表1衍生试剂及其制备方法 衍生试剂 制备方法 硼酸缓冲液 0.1M十水合四硼酸钠 (7.6g Na，BO，.10 ( Reagent A) H，O in 200mL H，O)， 用5M NaOH调pH至 10.2 OPA母液 50mg/mL邻苯二甲醛甲醇溶液 OPA/MPA反应液 75mM 邻苯二甲醛， 225mM3-巯基丙酸的 0.1M 硼酸缓冲液， pH=10.2 (取0.8mL硼 ( Reagent B) 酸缓冲液、0.2mLOPA母液和20pL MPA) FMOC反应液 2.5mg/mL芴甲基氯甲酸甲酯乙腈溶液 (Reagent C ) 进样稀释液 ( Reagent D ) 50mL 流动相A， 加0.75mL 磷酸 (85%) 注：硼酸缓冲液、OPA母液和进样稀释液建议7天配制一次，OPA/MPA反应液和FMOC反应液需每天临用新配。 2.2.2标准品溶液制备：取2.1.3中17种氨基酸标准品溶液(2.5umol/mL)，临用时用水稀配配制成浓度为10~500pmol/uL的系列标准溶液。 2.2.3样品溶液制备：取氨基酸注射液样品，临用时用水稀释500倍得到氨基酸样品工作溶液，待分析。 2.3在线针内衍生程序 和常规进样方式相比，在线针内衍生方法需要使用VanquishCore液相的用户自定义进样程序功能(User Defined Pro-gram， UDP)，氨基酸在线针内衍生程序见图1。 No Command Parameters 1 UDP_PrepareLiquidHandling Volume=75 [p] 2 UDP_Draw Position=Air， Volume=1[p].Speed=1[pl/s] 3 UDP_Draw Position=R：A2. Volume=2.5 [u]. Speed=1 [pl/s] 4 UDP_Draw Volume=2[p]. Speed=1[pl/s] 5 UDP_Draw Position=Air， Volume=3.5[]. Speed=3.5[pl/s] 6 UDP_InNeedleMix Volume=3.5[p].DrawSpeed=20 [pl/s]. DispenseSpeed=20[pl/s]. Cycles=5 7 UDP_Wait 12[s] 8 UDP_NeedleWash Duration=10 [s] 9 UDP_Draw Position=R：A3， Volume=2 [d]. Speed=1 [pl/s] 10 UDP _Draw Position=Air， Volume=4[p]. Speed=4 [pl/s] 11 UDP_InNeedleMix Volume=5.5 [p].DrawSpeed=20 [pl/s]. DispenseSpeed=20 [pl/s]. Cycles=10 12 UDP_NeedleWash Duration=10 [s] 13 UDP_Draw Position=R：A4.Volume=3 [p]. Speed=1[pl/s] 14 UDP_Draw Position=Air， Volume=5 [ul]. Speed=5[pl/s] 15 UDP_InNeedleMix Volume=8.5[p].DrawSpeed=20[pl/s]. DispenseSpeed=20[pl/s].Cycles=10 16 UDP_NeedleWash Duration=10 [s] 17 UDP_Draw Position=R：A5，Volume=32[p].Speed=20[pl/s] 18 UDP_Draw Position=Air， Volume=20 []. Speed=20 [pl/s] 19 UDP_InNeedleMix Volume=20 [p]. DrawSpeed=20 [pl/s]. DispenseSpeed=20 [pl/s]. Cycles=9 20 UDP_NeedleWash Duration=10 [s] 21 UDP_PrepareInject 图1.在线针内衍生程序 ( Position R：A2， Reagent A： 硼酸缓冲液； Position R：A3，Reagent B：OPA/MPA反应液； Position R：A4， ReagentC： FMOC反应液； Position R：A5， Reagent D： 进样稀释液) 2.4色谱条件 系统连接图见图1。色谱条件见表2。 图2.系统连接图 Time， min A% B% 0 97 0 3 2.2 97 3 30 85 60 40 35 30 70 38 30 70 38.5 97 3 45 97 3 51 100 0 60 100 0 检测 器 VWD： 338nm，263nm(脯氨酸) CAD， 蒸发温度：50℃；采集频率：5Hz；过滤常数：3.6s 进样模式 Custom： UDP Normal 进样量 2 pL 10 pL 3.实验结果与讨论 3.1在线针内衍生-紫外检测法测定结果 本方法结合OPA&FMOC衍生试剂和Vanquish Core在线针内衍生功能，能够实现17种氨基酸的在线自动化衍生、分析，方法简便，无需手动衍生，节省了试剂消耗。在前期方法基础上叫，本文将在线针内衍生方法从原Ultimate3000液相色谱平台成功转移至Vanquish Core平台，同时结合变色龙7.3软件，将原复杂冗繁的近85步在线衍生程序命令缩短至21步，大大提升了衍生程序编辑效率。另外，由于17种氨基酸中，脯氨酸是二级级，需要用FMOC试剂衍生并采用263nm波长检测，通常检测器选择是选择二极管阵列检测器，或单通道紫外检测器结合波长切换，而本文结合Vanquish Core的Variable Wavelength Detector双通道特点，无需波长切换即可实现两个波长的同时检测。 在线针内衍生-紫外检测法分析氨基酸标准品和氨基酸注射液样品谱图见图3，线性等相关结果见表3。各氨基酸峰形良好，可实现良好分离，其中脯氨酸是二级胺，需要用FMOC试剂衍生并采用263nm波长检测，杂质峰较多，对低浓度测定有一定干扰，可能是受衍生试剂的影响。17种氨基酸在25~500 pmol/uL浓度范围内，线性相关系数均大于0.99。 图3.在线针内衍生-紫外检测法分析氨基酸标准品(上)和注射液样品(下)谱图 (注：标准品中无半胱氨酸Cys和色氨酸Trp；样品中无胱氨酸Cys-Cys； Pro， 263 nm) 编号 氨基酸 保留时间， 线性范围， 相关系数R2 线性方程 LOQ， LOD， min pmol/uL pmol/uL pmol/uL 1 Asp 4.713 25~500 0.9966 y=0.0012x+0.0207 4.88 1.46 2 Glu 7.754 25~500 0.9920 v=0.0021x+0.0561 2.05 0.62 3 Ser 11.054 25~500 0.9939 y=0.0033x+0.0688 1.67 0.50 4 His 13.013 25~500 0.9972 V= 0.0019x+0.0248 3.39 1.02 5 Gly 13.988 25~500 0.9994 v=0.0041x+0.0182 1.77 0.53 6 Thr 14.404 25~500 0.9929 y=0.0020x+0.0484 2.83 0.85 7 Arg 14.888 25~500 0.9974 v= 0.0041 x+0.0511 1.59 0.48 8 Ala 17.204 25~500 0.9957 y=0.0027x+0.0559 2.14 0.64 9 Cys-Cys 19.796 25~500 0.9919 y= 0.0021x+0.0541 2.64 0.79 10 Tyr 20.979 25~500 0.9999 V=0.0026×-0.0188 3.33 1.00 11 Val 24.438 25~500 0.9919 y=0.0016x+0.0368 5.03 1.51 12 Met 24.746 25~500 0.9942 y=0.0040x+0.0950 1.43 0.43 13 Phe 27.588 25~500 0.9911 v=0.0021x+0.0477 2.98 0.89 14 le 28.213 25~500 0.9907 y=0.0019x+0.0458 3.51 1.05 15 Leu 29.563 25~500 0.9960 y= 0.0031x+0.0356 5.13 1.54 16 Lys 31.696 25~500 0.9936 v=0.0024x+0.0574 2.82 0.85 17 Pro (263 nm) 34.35 25~500 0.9963 y=0.0076x+0.3893 1.49 0.45 3.2 非衍生-电雾式检测法测定结果 在线针内衍生-紫外检测法虽然在衍生阶段实现自动化，但仍需手动配制多种成分复杂的衍生试剂，配制过程复杂耗时，且衍生试剂稳定性不一，易影响衍生效果和方法稳定性。而结合赛默飞特色的电雾式检测器和Hypercarb多孔石墨化碳色谱柱，可以实现无需衍生直接分析，大大简化了前处理步骤。 17种氨基酸可以实现良好分离，峰形尖锐，柱效高。其中标准品中胱氨酸和亮氨酸出峰虽有一定重合，但实际注射液样品中并无胱氨酸，故不会干扰亮氨酸的检测和定量(样品中实际为半胱氨酸，保留时间在8.2min左右，和其他氨基酸亦可实现良好分离)。17种氨基酸在10~500pmol/uL浓度范围内，使用二次函数拟合，相关系数普遍大于0.999。非衍生-电雾式检测法分析氨基酸标准品和氨基酸注射液样品谱图见冬4，线性等相关结果见表4。 表4非衍生-电雾式检测法线性结果 编号 氨基酸 保留时间， 线性范围， 拟合方程 相关系数R2 LOQ， LOD， min pmol/uL pmol/uL pmol/uL 1 Gly 3.313 10~500 y=-1.25E-06x2+0.0029x-0.0043 0.9999 7.69 2.31 2 Ser 3.98 10~500 V=-1.57E-06x2+0.0032x-0.0017 0.9999 2.92 0.88 3 Ala 5.397 10~500 y=-1.48E-06x2+0.0038x-0.0113 0.9999 2.79 0.84 4 Thr 7.246 10~500 y=-7.79E-07x2+0.0037x+0.1322 0.9997 1.27 0.38 5 Asp 9.653 10~500 y=-1.47E-06x2+0.0038x-0.0185 0.9999 3.32 1.00 6 Pro 10.64 10~500 y=-2.13E-06x2+0.0056x-0.0258 0.9999 2.16 0.65 7 Glu 14.303 10~500 v=-2.20E-06x2+0.0053x-0.0022 0.9999 0.64 0.19 8 Val 16.276 10~500 y=-2.34E-06x2+0.0069x-0.0217 0.9999 4.00 1.20 9 Lys 19.179 10~500 y=-5.18E-06x2+0.0117x+0.0149 0.9997 2.05 0.61 10 Cys-Cys 20.775 10~500 y=-1.76E-06x2+0.0059x+0.0034 0.9999 0.29 0.09 11 Leu 20.862 10~500 y=-5.61E-06x2 +0.0113x+0.0277 0.9995 2.91 0.87 12 Met 21.421 10~500 V=-2.67E-06x2+0.008x-0.0156 0.9999 2.61 0.78 13 lle 22.354 10~500 y=-3.57E-06x2+0.0092x-0.0001 0.9999 0.35 0.11 14 His 25.476 10~500 y=-5.96E-06x2 +0.013x+0.0106 0.9998 2.07 0.62 15 Arg 28.826 10~500 y=-1.51E-05x2+0.0207x+0.4295 0.9985 1.32 0.40 16 Phe 33.968 10~500 y=-8.13E-06x2+0.0138x+0.1426 0.9982 1.43 0.43 17 Tyr 34.379 10~500 y=-7.20E-06x2+0.0138x+0.2304 0.9981 4.48 1.35 3.3在线针内衍生-紫外检测法和非衍生-电雾式检测法测定结果比较 本文比较了两种检测方法在线性、灵敏度及重现性方面的差异，具体结果见表3、表4和图5。两种方法均可对17种氨基酸实现良好分离(实际可分析18种氨基酸，标准品中无色氨酸Trp)。两种方法在灵敏度方面基本相当(按S/N=3计算检测限LOD， 按S/N=10计算定量限LOQ)，个别氨基酸略有差异。但在重现性方面，非衍生-电雾式检测方法峰面积RSD均在2%以下，相对在线针内衍生-紫外检测法的峰面积RSD普遍在2%以上，个别甚至大于3%，非衍生-电雾式检测方法体现出较大的优势，主要原因可能跟衍生试剂本身稳定性、衍生产物稳定性以及衍生化效率等因素有关。非衍生-电雾式检测方法连续进样6针的氨基酸标准品检测重复性谱图见图6. 图5两种检测方法峰面积重现性比较 图6非衍生-电雾式检测法分析氨基酸标准品重复性谱图(n=6) 本文在赛默飞全新Vanquish Core液相色谱平台上，结合OPA&FMOC衍生试剂和Vanquish Core用户自定义进样功能实现了在线针内衍生氨基酸分析，同时结合赛默飞特色的电雾式检测器和Hypercarb多孔石墨化碳色谱柱，实现了无需衍生的直接分析氨基酸方法。前者实现了在线衍生自动化，同时提升了衍生程序编辑效率，后者可以实现无需衍生直接分析，大大简化了前处理步骤。两种方法在灵敏度方面基本相当，但在重现性方面，非衍生-电雾式检测方法体现出较大的优势，为相关制药及食品等行业客户在氨基酸检测方面提供了新的思路。 ( 1Thermo Fisher.Automated In-Needle Derivatization Applyinga U ser-Defined P rogram for the Thermo Sc i entific D i onexWPS-3000 Sp l it-Loop Autosampler. Technical N o te 107. ) ( r赛默飞世尔科技.17种氨基酸的RSLC分析方法. ApplicationNotes_C_LC-30. ) ( 赛默飞世尔科技.在线柱后衍生分析氨基酸. Application Notes_C_LC-66. ) 本文在赛默飞全新Vanquish Core液相色谱平台上，结合OPA&FMOC衍生试剂和Vanquish Core用户自定义进样功能实现了在线针内衍生氨基酸分析，同时结合赛默飞特色的电雾式检测器和Hypercarb多孔石墨化碳色谱柱，实现了无需衍生的直接分析氨基酸方法。前者实现了在线衍生自动化，同时提升了衍生程序编辑效率，后者可以实现无需衍生直接分析，大大简化了前处理步骤。两种方法在灵敏度方面基本相当，但在重现性方面，非衍生-电雾式检测方法体现出较大的优势，为相关制药及食品等行业客户在氨基酸检测方面提供了新的思路。