肝素钠产品中多硫酸软骨素检测方案(离子色谱仪)

ThermoSCIENTIFIC 离子色谱针对肝素钠的测定 SY RVE 1IE TOH 130 0960 TAPE 关注药物安全关爱您的健康 ICS系列离子色谱仪 在2010版中国药典中的应用 肝素钠 帕米磷酸二钠氯膦酸二钠及其制剂 盐酸头孢吡肟中的N-甲基吡咯烷 2010年7月1日开始执行的中华人民共和国药典2010版与以往药典最大的不同之一是新增了离子色谱检测法，同时在附录中增加了离子色谱检测方法及说明。 赛默飞世尔科技作为世界上先进的离子色谱技术的研发及制造者，为满足用户各种分析需求，提供完整的离子色谱解决方案以及多型号的离子色谱仪，本资料汇集了2010版药典有关离子色谱的检测项目，并附录了药典中对离子色谱技术的描述，用以方便广大用户参考。 目 录 1、 离子色谱法针对肝素钠的测定.. 2 a)肝素钠的离子色谱法鉴别.... 2 b)肝素钠中有机杂质分析-半乳糖胺限度测定.. .3 2.帕米磷酸二钠离子色谱法测定. 4 3.、氯膦酸二钠及其制剂的含量与有关物质离子色谱法测定.. 5 4.离子色谱电导检测法检测盐酸头孢吡肟中的N-甲基吡咯烷... .(6 5、 附录. 7 a) 2010版中国药典附录VJ离子色谱法.. 7 b) 美国药典有关肝素钠检测.... .9 离子色谱针对肝素钠的测定 肝素钠的离子色谱法鉴别(本方法符合2010版中国药典以及美国药典方法) 肝素钠中多硫酸软骨素的测定是这次2010年中国药典中新增的肝素钠测定的内容，主要针对肝素钠以及肝素钠注射液中多硫酸软骨素的鉴别以及含量确定，同时该方法也与美国药典方法相似： 色谱条件： 图1.系统适用性实验谱图：溶液组成：0.2mg/mL硫酸皮肤素 (DS)；0.2mg/mL多硫酸软骨素 (OSCS) ；20mg/mL肝素钠(Heprin) 图2.肝素钠产品谱图 戴安离子色谱符合美国药典针对肝素钠中的葡萄糖胺以及半乳糖胺的杂质进行分析的方法。 色谱条件： AminoTrap氨基酸捕获柱， 50×4mmCarboPac PA20分析柱，150×3mm 淋洗液：0-10min， 14mM NaOH； 10.1-15 min，200 mM NaOH； 15.1-20min， 14 mM NaOH 流速：0.5mL/min Au工作电极pH-Ag-AgCl参比电极 标准糖四电位波形 进样体积：10pL 实际样品测定谱图 肝素钠中半乳糖胺限度测定 样品前处理：称取12mg肝素钠，于10mL玻璃管中，加5mL 5N盐酸溶解，密闭。100度加热样品溶液6小时，冷却至室温，转移溶液于500mL容量瓶，用水稀释至刻度，过0.22um滤膜后进样。 肝素钠粗品中半乳糖胺的测定 样品前处理：精密称取肝素钠适量，，于10mL玻璃管中，加5 mL 5N盐酸溶解，密闭。100度加热样品溶液6小时，冷却至室温，加水稀释100倍，过0.22um滤膜后进样。 图4.系统适用性实验谱图 溶液组成：1.6mg/mL葡萄糖胺； 16pg/mL半乳糖胺；均溶于5NHCl。二者等体积混合。 图5.肝素钠产品中半乳糖胺限度测定谱图 图6.肝素钠粗品中半乳糖胺限度的测定谱图 帕米磷酸二钠离子色谱法测定 (符合2010年中国药典方法) 2010年中国药典方法中针对帕米磷酸二钠注射液以及注射用帕米磷酸二钠中帕米膦酸二钠含量测定有了确定的方法： ●色谱普： IonPac AS22戴安阴离子分析柱，250×4mmIonPac AG22戴安阴离子保护柱，50×4mm ●检测器：非抑制型电导检测器 ●淋洗液：3mM草酸 ●流速：：1.2mL/min● 进样体积：25uL 图7.标准浓度100ppm， 500ppm及1000ppm的帕米膦酸二钠色谱叠加图 氯膦酸二钠及其制剂的含量与有关物质测定 (符合2010年中国药典方法) 2010年中国药典中增订了氯膦酸二钠及其胶囊与注射液中的氯膦酸二钠的含量测定，规定的离子色谱条件： ●色谱柱：IonPac AS 11戴安阴离子分析柱，250×4mmIonPac AG 11戴安阴离子保护柱，50×4mm 汁淋洗液： KOH等度淋洗：45mM木 柱温：30℃ 流速：1.2mL/min 检测器：电导检测器 抑制器： ASRS 300 4mm 进样体积：25uL 图8.氯膦酸二钠标准溶液色谱图 有关物质测定规定的色谱条件： 色谱柱： IonPac AS 11戴安阴离子分析柱，250×4mmIonPac AG 11戴安阴离子保护柱，50×4mm ●沐淋洗液： KOH梯度淋洗(0-20min， 20-50mM； 24-25min， 50-20mM；25-30min， 20mM) 木柱温：30℃●流速：1.1.2mL/min木检测器：电导检测器 抑制器： ASRS 300 4mm 进样体积：25pL 图9.系统适用性测试谱图 供试品溶液(1.2mg/mL无水氯膦酸二钠) 对照溶液(12pg/mL无水氯膦酸二钠) 取氯化钠、亚磷酸与磷酸对照品，精密称定，分别加水溶解并定量稀释制成每1ml中含氯离子0.6ug、亚磷酸6ug与磷酸6ug的溶液，作为对照品溶照(1)、(2)和(3)。 离子色谱电导检测法检测盐酸头孢吡肟中的N-甲基吡咯烷 (符合2010版中国药典方法) 2010版药典中对盐酸头孢吡肟中的N-甲基吡咯烷的检测方法为电导检测法 样品处理： N-甲基吡咯烷标准溶液，称取一定量标准品，用10mM硝酸稀释到所需浓度。样品称取0.088g溶解在10mL淋洗液中。直接进样。 进样速度：0.9mL/min 色谱柱类型：阳离子柱 IonPac CS15，25uL定量环 检测方式： CSRS抑制型电导检测，外加水模式 淋洗液组成：9mMHNO，+15%乙腈 峰名 浓度(ppm) 样 品中百分比含量 4-N甲基吡咯烷 9.17 0.10% 样品中百分比含量=测得样品溶液浓度×溶液体积/样品称取量 ( 注释： 1、参见2010版药典366页 ) ( 2、参加本资料附录二 ) 3、参见2010版药典457-459页 4、参见2010版药典1034-1035页 5、参见2010版中国药典671页 附录一：2010版中国药典附录VJ离子色谱法 2010版中国药典附录VJ离子色谱法 离子色谱法系采用高压输液泵系统将规定的洗脱液泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱分析方法。注入的供试品由洗脱液带入色谱柱内进行分离后，经过抑制器或衍生系统进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录色谱信号。离子色谱法常用与无机阴离子、无机阳离子、有机酸、醇糖类、氨基糖类、氨基酸、蛋白质、糖蛋白等物质的定性和定量分析。它的分离机理主要为离子交换，即基于离子交换树脂上可解离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子之间进行的可逆交换；离子色谱法其他分离机理还有形成离子对、离子排阻等。 1、对仪器的一般要求 离子色谱仪器中所有与洗脱液或供试品接触的管道、器件、均应使用惰性材料，如聚醚醚酮(PEEK) 等。仪器应定期检定并符合有关规定。 (1)色谱柱离子交换色谱的色谱柱填充剂有两种，分别是有机聚合物载体和无机载体填充剂。 有机聚合物载体填充剂最为常用。填充剂的载体一般为苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、乙基乙烯基苯-二乙烯基苯共聚物、聚甲基丙烯酸酯等有机聚合物。这类载体的表面通过离子键附聚了大量具有阴离子交换功能基(如烷基季铵基、烷醇季铵基等)或阳离子交换功能基(如磺酸、羧酸、羧酸-磷酸和羧酸-磷酸冠醚等)的乳胶微粒，可分别用于阴离子或阳离子的交换分离。有机聚合物载体填充剂在较宽的酸碱范围(pH0-14)内具有较高的稳定性，具有一定的耐有机溶剂腐蚀性。 无机载体填充剂一般以硅胶为载体。在硅胶表面的硅醇基通过化学键合季铵基等阴离子交换功能基或磺酸基、羧酸基等阳离子交换功能基，可分别用于阴离子或阳离子的交换分离。硅胶载体填充剂机械稳定性好、在有机溶剂中不会溶胀或收缩。硅胶载体填充剂在pH2-8的洗脱液中稳定， 般适用于阳离子样品的分离。 (2)洗脱液离子色谱对负载样品的分离主要依赖于色谱柱的填充剂，而洗脱液相对较为简单。分离阴离子场常采用稀碱溶液、碳酸盐缓冲液等作为洗脱液；分离阳离子常采用稀甲烷磺酸溶液等作为洗脱液。通过增加或减少洗脱液中酸碱溶液的浓度可提高或降低洗脱液的洗脱能力；在洗脱液内加入适当比例的有机改性剂，如甲醇、乙腈等可改善色谱峰峰形。制备洗脱液的去离子水应经过纯化处理，电导率一般小于0.056uS/cm。使用的洗脱液需经脱气处理，常采用氮气在线脱气的方法，也可以采用超声、减压过滤或冷冻的方式进行离线脱气。 (3)检测器电导检测器是离子色谱常用的检测器，其他检测器有紫外检测器、安培检测器、蒸发光散射检测器等。 电导检测器主要用于测定无机阴离子、无机阳离子和部分极性有机物，如羧酸等。离子色谱法中常采用抑制型电导检测器，即使用抑制器将具有较高电导率的洗脱液在进入检测器之前中和成具有极低电导率的水或其他较低电导率的溶液，从而显著提高电导检测的灵敏度。 安培检测器用于分析解离度低、但具有氧化或还原性质的化合物。直流安培检测器可以测定碘离子(T)、硫氰酸根离子 (SCN)和各种酚类化合物等。积分安培检测器和脉冲安培检测器则常用于测定糖类和氨基酸类化合物。 紫外检测器适用于在高浓度氯离子等存在下痕量的溴离子(Br)、亚硝酸根离子(NO，)、硝酸根离子(NO，)以及其他具有强紫外吸收成分的测定。柱后衍生-紫外检测法常用于分离分析过渡金属离子和镧系金属等。 蒸发光散射、原子吸收、原子发射光谱、电感耦合等离子体原子发射光谱、质谱(包括电感耦合等离子体质谱)也可作为离子色谱的检测器。离子色谱在与蒸发光散射检测器和(或)质谱检测器等联用时，一般采用带有抑制器的离子色谱系统。 2、样品处理 离子色谱法的色谱柱填充剂大多数不兼容有机溶剂，一旦污染后不能用有机溶剂清洗，所以离子色谱法对样品处理的要求较高。对于基质简单的澄清水溶液-—-般通过稀释和0.45um滤膜过滤后直接进样分析。对于基质复杂的样品，可通过微波消解、紫外光降解、固相萃取等方法去除干扰物后进样分析。 3、系统适用性试验 照高效液相色谱法(附录VD)项下相应的规定。 4、测定法 (1)内标法 (2)外标法 (3)面积归一化法 上述((1)-(3)法的具体内容均同高效液相色谱法(附录VD)项下相应的规定。 (4)标准曲线法按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品适量配制成贮备液。分别量取贮备溶液配制成一系列梯度浓度的对照溶液。量取上述梯度浓度的对照品溶液夜适量注入仪器，记录色谱图。测量对照品溶液中待测组分的峰面积或峰高。以标准溶液的峰面积或峰高为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标，回归计算标准曲线，其公式为： Ag=a. Cp+b 式中Ag为对照溶液的峰面积或峰高 C为对照溶液的浓度 a为标准曲线的斜率 b为标准曲线的截距 再取各品种项下供试品溶液，注入色谱仪，记录色谱，测量供试品溶液中待测成分(或其杂质)的峰面积或峰高。按下式计算其浓度： 式中Ag为供试品溶液的峰面积或峰高； C为供试品溶液的浓度； a，b符号的意义同上。 上述测定法中，以外标法和标准曲线法最为常用 (以上参见中国药典2010版附录38-39页) 附录二：美国药典有关肝素钠检测 摘自： Pharmacopeial Forum， Vol.35(2) [Mar.-Apr. 2009]，1-10 肝素钠 B.肝素钠的色析法鉴别 溶液A： 溶解0.8g NaH，PO 于2L水，用磷酸调节pH值到3.0。用0.45 um膜过滤溶液，临用前脱气。 溶液B： 溶解0.8g NaH，PO 和280 g NaClO 于2L水中，用磷酸调节pH到3.0。用0.45um膜过滤溶液，临用前脱气。 流动相：按照下列梯度： 时间(min) 溶液A(%) 溶液B(%) 洗脱 0 80 20 平衡 60 10 90 线性梯度 61 80 20 线性梯度 75 80 20 再平衡 硫酸皮肤素标准溶液：20mg/mL USP Dermatan Sulfate RS 于水中 多硫酸软骨素标准溶液：20mg/mL USP Oversulfated Chondroitin ulfate RS 水溶液 标准溶液：不低于20mg/mL USP Heparin 系统适用性溶液：系统适用性溶液含有 1%(v/v)硫酸皮肤素、多硫酸软骨素的标准溶液。 样品溶液：不低于20mg/mL肝素钠水溶液 色谱系统 模式：液相色谱 检测器： UV202 nm 色谱柱：2mm×25cm； L61 (IonPac AS11戴安阴离子分析柱) 保护柱：2mm×50mm； L61 (IonPac AG11戴安阴离子保护柱) 流速：0.22mL/min 进样体积：10pL 系统适用性 样品：系统适用性溶液 注意硫酸皮肤素、肝素和多硫酸软骨素的保留时间约为20，30和50 min。 适用性要求 分离度：硫酸皮肤素和肝素的分离度不低于1.0，肝素和多硫酸软骨素的分离度不低于1.5 相对偏差：三次重复进样，肝素峰不大于2% 测定 样品：标准溶液和样品溶液 按照上述色谱条件，测定主峰的保留时间 验收标准：样品溶液的主峰与标准溶液主峰的保留时间一致 肝素钠中的有机杂质： 总氨基己糖中半乳糖胺的限度(硫酸皮肤素和其他半乳糖胺杂质的测定) 流动相：14mM氢氧化钾 葡萄糖胺标准溶液：1.6 mg/mL USP Glucosamine Hydrochloride RS， 溶于5N盐酸中 半乳糖胺标准溶液：16ug/mLofUSP Galactosamine Hydrochloride RS， 溶于5N盐酸中 标准溶液： Glucosamine标准溶液和Galactosamine 标准溶液等量混合 水解标准溶液：转移5mL标准溶液于7mL带螺帽试管中，盖上盖子，100度加热6小时。冷却至室温，定量转移溶液于500mL容量瓶中，用水稀释至刻度。 样品溶液：转移12mg肝素钠于7mL带螺帽试管中，溶解5mL5N盐酸中，盖上盖子。 水解样品溶液：100度加热样品溶液6小时，冷却至室温，转移溶液于500mL容量瓶，用水稀释至刻度。 step Time(S) Potential(v) Integration 1 0.01 0.1 2 0.20 0.1 Begins 3 0.40 0.1 Ends 4 0.41 -2.0 5 0.42 -2.0 6 0.43 +0.6 7 0.44 -0.1 8 0.50 -0.1 色谱系统 模莫： HPIC 检测器：脉冲安培检测器，波形：该波形为糖检测的四电位波形 色谱柱：3mm*30mm 氨基酸捕获柱，，3×30mm 保护柱和3 mm×15cm分析柱(CarboPac PA20) 柱温：保持在30度 流速：0.5mL/min 预平衡：流动相至少60 min 进样量：10pL 洗脱：流动相10 min 色谱柱清洗：100mMKOH洗至少10 min 平衡：每次进样前，流动相平衡至少10 min 系统适用性 样品：水解标准溶液 适用性要求： 分离度：半乳糖胺和葡萄糖胺峰不低于2 柱效：葡萄糖胺理论塔板数不低于2000 拖尾因子：半乳糖胺和葡萄糖胺峰在0.8和2.0之间 测定 样品：水解标准溶液水解样品溶液 记录色谱图，测定与半乳糖胺和葡萄糖胺保留时间相应的峰的响应值 计算半乳糖胺和葡萄糖胺在水解标准溶液中的响应值之比： (GalNB/GalNW)x(GlcNW/GlcNB) GalNB=水解标准溶液中半乳糖胺峰面积 GalNW=标准溶液中半乳糖胺的重量 GlcNB=水解标准溶液中葡萄糖胺的峰面积 GluNW=标准溶液中葡萄糖胺的重量 计算总氨基己糖中半乳糖胺的百分比： [(GalNU/GalNR)]/[(GalNU/GalNR)+GlcNU]×100 GalNU=水解样品溶液中半乳糖胺的峰面积 GalNR=半乳糖胺相应值比 GlcNU=水解样品溶液葡萄糖胺的峰面积 验收标准：水解样品溶液中的半乳糖胺在总氨基己糖中的含量不超过1%。 赛默飞世尔科技戴安离子色谱可广泛应用于环保、疾控、给排水、公安、烟草、农业、质检、医药、化工、电力能源、电子电镀、食品化工、科研院所等领域中的无机阴阳离子及有机酸碱、糖、氨基酸、抗生素等的分析。 ICS-1600/ICS-1100/ICS-900离子色谱 由先进的输液泵、恒温电导检测器、柱箱组成。 可选配多种检测器以及多用途的AS系列样品前处理和自动进样系统。 可轻松完成ppm-ppt级分析，广泛应用于环境分析、药品及食品安全、质量控制等领域。均可升级为免化学试剂离子色谱 (RFIC) 系统。ICS-2100离子色谱ICS-2100是世界上第一款同时集淋洗液在线发生器((RFIC-EG) 和免化学试剂电解样品前处理装置(RFIC-ESP) 于一体的离子色谱仪。具有等度和梯度淋洗功能。2mm体系色谱柱与4mm体系色谱柱均可在该仪器上完成工作。可选配电导、电化学、紫外/可见、荧光、二极管阵列、质谱等各种检测器以及多用途的AS系列样品前处理和自动进样系统。可用于阴离子、阳离子、过渡金属、有机酸等的分析。 赛默飞世尔科技 上海 上海浦东新金桥路27号6号楼 邮编：201206 电话：021-68654588 传真：021-63848294 北京 北京东城区安定门东大街28号 雍和大厦西楼F座7层 邮编：100007 电话：010-84193588 传真：010-84193589 销售热线 北京 电话：010-64436740/1 传真：010-64432350 上海 电话：021-68654588 传真：021-63848294 广州 电话：020-87684181 传真：020-87684169 成都 电话：028-65545388/29 传真：028-85032858 应用支持热线 北京：010-82384339 上海：021-58957001 服务热线 8008105118 4006505118 www.thermo.com.cn ICS-5000多功能离子色谱仪 ICS-5000是赛默飞世尔科技最新推出的最 高端研究级色谱系统，也是赛默飞世尔科技推出 的世界上第一台毛细管离子色谱系统，全新的模 块设计具有极大的灵活性、功能更全面，操作更 简便，其完美卓越的性能将色谱分析带入一个新 的更高境界。 通过毛细管系统以及分析系统的整合组成 的ICS-5000多功能型离子色谱系统，能应对未来 潜在的挑战以及高级应用，该系统提高了工作效 率，扩展了工作能力、提高了色谱性能。 ICS-5000 欲知更多信息，请浏览我们的网站：www.thermo.com.cn SCIENTIFIC ·· 实际样品测定谱图 肝素钠中半乳糖胺限度测定 样品前处理：称取12mg肝素钠，于10mL玻璃管中， 加5mL 5N盐酸溶解，密闭。100度加热样品溶液6小时，冷 却至室温，转移溶液于500mL容量瓶，用水稀释至刻度， 过0.22µm滤膜后进样。 肝素钠粗品中半乳糖胺的测定 样品前处理：精密称取肝素钠适量，于10mL 玻璃管中，加5mL 5N盐酸溶解，密闭。100度加热 样品溶液6小时，冷却至室温，加水稀释100倍，过 0.22µm滤膜后进样。