体液中D/L-安非他明检测方案(超临界色谱)

D/L-安非他明手性分离方法的开发利用 SFC/MS 对真实的全血样品进行定量测定 应用简报 法医毒理学，刑侦学 作者 摘要 Melanie Muelek， Herbert Godel，Edgar Naegele 安捷伦科技有限公司 本应用简报介绍了使用 Agilent 1260 Infinity II SFC 系统开发 D/L-安非他明的手性分离方法。研究证明 Agilent 6495 三重四极杆质谱系统可用于这两种手性对映体形式的定量分析。介绍了方法开发过程，并利用最终分析方法确定校准曲线和三重四极杆质谱的定量限。展示了对经过处理的真实全血样品的分析。 Agilent Technologies 前言 化合物 D/L-安非他明具有两种手性对映体形式(图1)。D-安非他明异构体的活性更高，在制药过程中以纯对映体形式生产。 图1.D-安非他明和L-安非他明的化学式 在法医毒理学中，可利用色谱法(如HPLC与质谱联用法)对体液中的安非他明进行定性和定量测定。 ( 本应用简报介绍了使用三重四极杆质谱仪开发用于分离并定量测定 D-安非他明和L-安非他明的快速分析 SFC/MS 方法。该分析方法能够区 分医用D-安非他明的量与非法来源的 D/L-安非他明的量。最后，通过分析真实的提取全血样品，对该方法在法 医毒理学领域的应用进行验证。 ) ( 实验部分 ) ( 仪 器 ) ( Agilent 1260 Infinity II SFC/MS 系统， 包括： ) ( Agilent 1 260 Infinity II SFC 控制模块(G4301A) ) ( Agilent 1260 Infinity II SFC 二元泵 (G4782A) ) ( Agilent 1260 Infinity lI SFCMultisampler (G4767A) ) ( Agilent 1260 Infinity II DAD (G7115A ) ， 配备高压 SFC 流通池 ) ( Agilent 1260 Infinity ll高容量柱 温箱(MCT) (G7116B)，带有四色 谱柱选择阀 ) ( Agilent 1260 Infinity lI等度泵(G7110B) 和 SFC/MS分流器套装 (G4309-68715) ) ( 采用安捷伦喷射流和 iFunnel 技术的 Agilent 6495 三重四极杆 MSD ) 仪器设置 Agilent 1260 Infinity II SFC 系统与安捷伦 LC/MS 系统的推荐配置如之前所述。 软件 ( Agilent OpenLAB CDS ChemStation 版 ， 适用于 LC 和 LC/MS系统， 修订版 C.01.07 SR3 ) ( Agilent MassHunter 三重四极杆采集软件， B.08.02版 ) Agilent MassHunter Optimizer软件， B.08.02版 ( Agilent MassHunter 离子源和iFunnel Optimizer 软件， B.08.02版 ) ( Agilent MassHunter 定量分析软 件， B.08.00版 ) ( Agilent MassHunter定性分析软 件， B .07.00 SP 1 版 ) 色谱柱 ( Chiral Technologies， CHIRALPAK AD-H 150×4.6 mm， 5 pm ) ( Chiral Technologies， CHIRALPAK AD-H 250×4.6 mm，5 pm ) ( Chiral Technologies，CHIRALPAK IA 250×4.6 mm，5 pm ) ( Chiral Technologies， CHIRALPAK IC 250×4.6 mm， 5 pm ) ( Chiral Technologies， CHIRALPAKID 250×4.6 mm， 5 pm ) ( 化学品 所有溶剂均购自德国 Merck 公司。 ) 样品 根据所述校准曲线的相关浓度，在甲醇中用各种储备液(储备液：分析物浓度为 1 ppm 的甲醇溶液)配制D-安非他明、L-安非他明和 D/L-安非他明溶液。 提供经处理的真实全血样品(参见“致谢”部分)。 样品前处理 用乙腈通过蛋白质沉淀法对真实的全血样品进行处理，并在分析前用流动相B(乙醇+0.1%NHg 水溶液)按1：1000/1：100/1：10 的比例进行稀释。 最终 SFC 方法 参数 值 SFC 流速 4mL/min 改性剂 乙醇+0.1%氨水 等度 10%改性剂 柱温 20°C BPR温度 60°C BPR压力 200 bar 总运行时间 3分钟 进样量 5pL 注入速度 400 pL/min 灌洗体积 4pL 三重四极杆质谱方法 参数 值 补偿流组成 甲醇/水(95/5)+0.2%甲酸 补偿流流速 0.4 mL/min 采用安捷伦喷射流离子源进行电喷雾电离 干燥气 170℃， 16 L/min 鞘气温度 300℃， 9 L/min 雾化器 60 psi 毛细管电压 2500V 喷嘴电压 500 V iFunnel 高压RF：80， 低压 RF： 60 质谱参数 ESI极性 正离子 扫描类型 MRM 离子对 2 分析周期 502 ms △EMV +200V 母离子 子离子 驻留时间 碎裂电压 碰撞能量 碰撞池加速器电压 化合物名称 (m/z) (m/z) (ms) (V) (V) (V) D/L-安非他明 136.1 119.1 250 380 7 1 D/L-安非他明 136.1 91.1 250 380 17 1 利用外消旋安非他明标准溶液(100ppb) 对四种不同的手性固定相色谱柱和两种有机改性剂进行筛选(参见“实验部分”色谱柱2至5)。由于安非他明是一种碱性化合物，因此在甲醇和乙醇中加入0.1%氨水.((碱性添加剂)并将其用作CO， 改性剂。在初始方法开发步骤中，在所有色谱柱上分别进行不同的等度分离。实验结果表明，色谱柱2上实现了初始分离(图2)。两种对映体的分离性能均随着改性剂用量的减小而增强。在所选条件下，采用甲醇无法实现基线分离。 为获得更出色的安非他明分离效果，在色谱柱2上对洗脱强度较弱的乙醇溶剂进行了测试(图3)。当改性剂浓度低于10%B时，两个对映体获得了清晰的分离。当改性剂浓度为10%B时，对映体在3.5至4.5分钟之间洗脱；当改性剂浓度为6%B时，对映体在7至9分钟之间洗脱。 图2.使用不同改性剂含量(改性剂B： MeOH+0.1%氨水，流速： 3mL/min， 柱温：20°℃，色谱柱： CHIRALPAK AD-H 4.6 × 250 mm， 5 um) 对 D/L-安非他明对映体(100 ppb) 的手性分离 图3.使用不同改性剂含量(改性剂B：EtOH+0.1%氨水，流速：3mL/min，柱温：20℃，色谱柱： CHIRALPAK AD-H 4.6 ×250 mm， 5 um) 对 D/L-安非他明对映体(100 ppb)的手性分离 在最终步骤中，将流速从3 mL/min提高至4 mL/min，对方法运行时间进行优化。提高流速后，导致对映体在2.5至3.2分钟之间洗脱(图4)。为进一步缩短运行时间，采用固定相、内径和粒径相同而柱长更短的色谱柱(色谱柱1，图5)。将 250 mm色谱柱改为更短的150 mm 色谱柱，将使两种对映体在1.5至2.1分钟之间提前洗脱。此外，对不同的温度(40、30、20℃)进行测试，结果发现采用20°℃的柱温能够获得最高的分离度(数据未示出)。 ×105 图4.使用不同流速(改性剂B： 10%EtOH+0.1%氨水，流速：3mL/min 和4mL/min，柱温：20℃，色谱柱： CHIRALPAK AD-H 4.6× 250 mm， 5 um) 对 D/L-安非他明对映体(100 ppb)的手性分离 图5.使用不同色谱柱尺寸(改性剂B：10%EtOH+0.1%氨水，流速：4mL/min， 柱温：20℃，色谱柱： CHIRALPAK AD-H 4.6×250 mm 和4.6×150mm， 5 pm) 对 D/L-安非他明对映体(100 ppb)的手性分离 最后，在转移到质谱仪离子源的过程中添加补偿溶剂以实现适当的电离，这一优化步骤用于获得最高灵敏度。为此，对不同的反压设置进行测试，因为借助分流器设置，反压可调节色谱柱洗脱物转移到离子源的量(图6)。对于最终方法，采用的反压为200 bar。 还考察了添加的补偿溶剂(甲醇/水(95/5)+0.2%甲酸)对流速的影响，但由于对灵敏度几乎没有影响，因此流速仍保持在 0.4 mL/min。对质谱的所有离子源参数进行全面优化，以获得最高的灵敏度(参见“实验部分”)。 为最终确认 SFC/MS方法，对市售纯对映体形式中的 D-安非他明和L-安非他明标准品单独进行了分析。单个峰来自相应的对映体：1.632分钟洗脱的L-安非他明和1.860分钟洗脱的D-安非他明(图7)。 图6.优化 SFC 反压设置以最大程度提高质谱灵敏度 ×106 图7.利用所开发的手性方法对市售光学纯D-安非他明和L-安非他明标准品 (100 ppb) 的手性分离结果。箭头指示D-安非他明标准品中的L-对映体杂质 为定量测定 D-安非他明和L-安非他明，分别绘制 100 ppt 至 100 ppb 的校准曲线，结果呈现出优异的线性(图8)。根据信噪比 (S/N) 为 10时的浓度，确定定量限(LOQ) 为100 ppt，并确定检测限(LOD) 为 40 ppt (S/N=3)。L-安非他明和D-安非他明的线性系数分别为0.9998 和0.9996。 为证明所开发 SFC/MS 方法的能力，使用所开发的方法对按照“实验部分”所述涉骤制备的实际全血样品进行测量。用改性剂B 按 1：10、1：100和1：1000 的比例对血液样品进行稀释(图9和表1)。表1列出了测得 的样品中的D-安非他明和L-安非他明的峰面积和峰高等详细信息，并证明安非他明在体内以外消旋形式存在，其主要来源于非药用毒品。图9显示了 1：1000 和1：10稀释液所对立的色谱图。 图8.校准曲线以及 100 ppt 的L-安非他明在保留时间1.632分钟处(A)和D-安非他明在保留时间 1.860分钟处(B)的定性/定量离子信号。获得的D-安非他明和L-安非他明之间的分离度大于1，总运行时间为3分钟 结论 本应用简报介绍了使用 Agilent 1260Infinity II SFC 快速分离D/L-安非他明对映体并使用 Agilent 6495三重四极杆质谱仪进行高灵敏度定量测定的方法开发。SFC分离能够在3分钟的总运行时间内完成，表明分析时间很快。定量测定的 LOQ 低于 100 ppt。 最后，表明所开发的方法成功应用于可靠测定全血制备样品中的安非他明。 致谢 感谢瑞典林雪平国家法医学委员会的Martin Josefsson 和 Markus Roman提供经处理的真实全血样品。 图9.用改女剂按1：10 (A)和1：1000 (B)比例稀释的经处理实际全血样品中的 D/L-安非他明 表1.用改性剂按1：10、1：100 和1：1000 的比例稀释制得的实际全血样品中D-安非他明和L-安非他明的详细测量结果 L-安非他明结果 D-安非他明结果 名称 RT 峰面积 峰高 RT 峰面积 峰高 Case 2 Dil 1_1000 1.574 14605.41 4129.08 1.780 14342.73 3159.12 Case 2 Dil 1_100 1.574 178409.64 48475.84 1.780 165744.26 34952.28 Case 2 Dil 1_100 1.574 165569.54 45037.95 1.780 154606.59 35124.32 Case 2 Dil 1_100 1.565 156671.29 44736.99 1.780 139086.04 32365.24 Case 2 Dil 1_10 1.565 2073946.07 561571.92 1.780 1780961.78 417402.00 ( 参考文献 ) 1. Heal， D. J； et al. Amphetamine， past and present - a pharmacological and clinical perspective. Journal of Psychopharmacology 2013， 27 (6)， 479-496 2. Kde Mariotti，C.； et al. Simultaneous analysis of amphetamine-type stimulants in plasma by solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry. J. Anal. Toxicology 2014，38(7)，432-437 3. Use of the SFC-MS Splitter Kit G4309-68715 (SFC-MS分流器 套装 G4309-68715的使用)， 安捷伦科技公司技术简报， 出版号 G4309-90130， 2015 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 用于司法鉴定。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 @安捷伦科技(中国)有限公司，2017 2017年10月15日，中国出版 5991-8262ZHCN Agilent Technologies 本应用介绍了使用 Agilent 1260 Infinity II SFC 快速分离 D/L-安非他明对映体并使用 Agilent 6495 三重四极杆质谱仪进行高灵敏度定量测定的方法开发。SFC 分离能够在 3 分钟的总运行时间内完成，表明分析时间很快。定量测定的 LOQ 低于 100 ppt。最后，表明所开发的方法成功应用于可靠测定全血制备样品中的安非他明。