血液制品中磷酸三丁酯残留量检测方案(气相色谱仪)

2 3 曾海龙余翀天赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词：血液制品；磷酸三丁酯；气相色谱。 目标：本文基于文献报道和药典方法《中国药典》2010年版第三部附录VIJ“磷酸三丁酯残留量测定法”，建立了以毛细管色谱柱TG-WAXMS(30mx0.25mm×0.25um)分析血液制品中磷酸三丁酯气相色谱法测定条件，以满足该行业客户群分析检测需求。 引言 血液制品是指各种人血浆蛋白制品，包括人血白蛋白、人胎盘血白蛋白、静脉注射用人免疫球蛋白、肌注人免疫球蛋白、组织胺人免疫球蛋白、特异性免疫球蛋白、乙型肝炎、狂犬病、破伤风免疫球蛋白、人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物、人纤维蛋白原、抗人淋巴细胞免疫球蛋白等。血液制品的原料是血浆。人血浆中有92%-93%是水，仅有7%-8%是蛋白质，血液制品就是从这部分蛋白质分离提纯制成的。国内有血液制品生产企业三十四家，正常开工的二十多家，年处理血浆量在100吨以上的仅十余家。磷酸三丁酯作为病毒灭活剂广泛使用于血液制品业中，因此建立磷酸三丁酯的残留检测方法是非常有必要的。 磷酸三丁酯化学分子结构式 磷酸三丁酯，中文代号TBP，中文别名：磷酸三丁酯、三丁基磷酸盐、磷酸正丁酯、三正丁基磷酸盐、磷酸三丁脂、磷酸三正丁酯、三丁基磷酸盐、磷酸三丁酸，分子式C12H27O4P； OP (OCH，CH，CH，CH3)、分子量 266.32。外观与性状：无色、有刺激性气味的液体；蒸汽压：2.67kPa/20℃；沸点：：(180-183)℃(2.87 kPa)；闪点：146℃(开口)；熔点<-79℃；表面张力：27.79 mN/m(20℃)；难溶于水，水中溶解性为 0.1%(25℃)。能与多种有机溶剂混溶；密度相对密度(水=1(0.9766；木对密度(空气=1)7.67；稳定；危险标记： R36/38 Irritant。健康危害：本品对人血、血浆中胆碱酯酶有轻度抑制作用。人经口，约100毫升，可引起呼吸困难、抽搐、麻痹、昏睡等症状。对皮肤有刺激作用。蒸气和烟雾对眼睛、粘膜和上呼吸道有刺激作用。接触后可引起中枢神经系统的刺激症状。 有毒理学资料如下： (1)毒性：对皮肤和呼吸道有强烈的刺激作用，具有全身致毒作用。。(2)急性毒性：LD503000 mg/kg(大鼠经口)； LC501.3g/m，6小时，(实验大鼠三只吸入)无死亡；人经口约100mL可引起呼吸困难、抽搐、麻痹、昏睡等症状。(3)亚急性和慢性毒性：豚鼠经皮1mL/kg/日×4日，2/3死亡。 目前关于磷酸三丁酯的检测方法有气相色谱法-FID(1-5]和气相色谱质谱法同，标准方法有GB/T15354-2011、药典方法《中国药典》2010年版第三部附录VIJ“磷酸三丁酯残留量测定法”旧。而用于分析磷酸三丁酯的色谱柱报道中主要有TM-FFAP柱、DB-WAX柱、PEG-20M、HP-5和HP-INNOWax。本实验采用毛细管色谱柱TG-WAXMS(30mx0.25 mmx0.25um)， 优化了初始柱温、进样口温度、检测器温度和升温速率等条件，建立了血液制品中磷酸三丁酯的气相色谱-FID检测器的测定方法，以磷酸三丙酯为内标，采用内标法定量。 ( 仪器 ) ( Thermo ScientificTM TRACE 1310气相色谱仪，配FID 检测器，包括： ) -配分流/不分流进样口 ( -AS/AL1310 自动进样器 ) Thermo Scientific Dionex ChromeleonTM 7 Version7.2.1.5833数据处理系统 Thermo ScientificTM毛细管色谱柱TG-WAXMS(30mx0.25mm×0.25um) ( P/N 26088-1420) Thermo ScientificTM不分流衬管(P/N 453A1925) Thermo Scientific TM低流失进样口隔垫(P/N31303233) Thermo ScientificTM气相色谱进样口石墨垫(P/N290GA139) Thermo Scientific TM 15mL塑料离心管(P/N339650) Thermo ScientificTM 2mL进样小瓶(P/N C4000-88W) Thermo ScientificTM 2mL进样小瓶样品架(5×10，C4012-25) Thermo ScientificTM 10~100pL移液器 (JH91538) Thermo Scientific TM 100~1000pL移液器(JH91348) 试剂与标准品 磷酸三丁酯AR分析纯(济宁铭达新材料有限公司)，纯度≥99%，磷酸三丙酯AR分析纯(北京华业寰宇化工有限公司)，纯度≥99%，正己烷(CH(CH2)4CH)， HPLC 级(Fisher Scientific UN1208)。 标准溶液的制备 取磷酸三丁酯(99%以上)，精密称定，用正己烷稀释成浓度30mg/mL的磷酸三丁酯标准液，备用。 内标溶液的制备 取磷酸三丙酯(99%以上)，精密称定，用正己烷稀释成浓度10mg/mL的磷酸三丙酯内标液，作为内标备用。 标准工作曲线溶液的制备 精密量取磷酸三丁酯标准液10pL、20uL、40pL、60uL、80uL，分别置已精密加水3mL的具塞玻璃离心管中，再分别精密加磷酸三丙酯内标液50pL， 振荡1 min，再加正己烷4mL， 振荡2 min， 以每分钟3500转离心5min。小心吸取上层正己烷，供气相色谱仪分析。 精密量取供试品3mL，置具塞玻璃离心管中，精密加磷酸三丙酯内标液50uL，振荡1min，再加正己烷4mL，振荡2min，以每分钟3500转离心5 min。小心吸取上层正己烷，供气相色谱仪分析。 制备方法同上，精密量取蒸馏水3mL，置具塞玻璃离心管中，分别添加入10pL、20pL、40pL三个水平标准品，各做6个平行样品，精密加磷酸三丙酯内标液50pL， 振荡1min， 再加正己烷4mL， 振荡2min， 以每分钟3500转离心5 min。小心吸取上层正己烷，供气相色谱仪分析。 GC条件 色谱柱： Thermo Scientific TM TG-WAXMS(30mx0.25mmx0.25pm， PN：26088-1420) 升温程序：60℃(2 min)， 25C/min to 240℃(3min)； 进样口： 进样口温度为240℃；不分流进样； FID检测器：检测器温度为240℃；空气：350mL/min；氢气：35mL/min；氮气：40mL/min。 载气： 高纯氦气(99.999%)，恒流模式，流速：1.2mL/min。 结果与讨论 气相色谱条件的建立 ：1))初始柱温的优化 配置磷酸三丙酯(内标)和磷酸三丁酯浓度分别为125pg/mL、600pg/mL的混标溶液。磷酸三丙酯比磷酸 图B 图1.不同初始柱温 三丁酯先出峰，设定不同初始柱温，分别为：40、50、60、80、100、120和140℃。其他气相色谱条件一致，考察初始柱温对色谱图的影响，从图1可以看出，温度从40~140℃，通过比较峰高、峰型、分离度和分析时间等因素，40>60>50>80>100>120>140，当温度从100℃时，峰型开始变形分叉，所以最终选择初始柱温为60℃。 2))不同进样口温度的优化 同上，初始柱温为60℃，其他气相色谱条件相同，设定不同进样口温度，分别为：150、160、170、180、190、200、210、220、230和240。考察不同进样口温度对色谱图的影响，从图2可以看出，随着进样口温度的升高，磷酸三丙酯和磷酸三丁酯的响应呈逐渐上升的趋势，当温度为240℃时，磷酸三丁酯变化最明显，响应超过磷酸三丙酯，所以选择进样口温度为240℃。 图2.不同进样口温度 3)不同检测器温度的优化 同上，初始柱温为60℃，进样口温度为240℃，其他气相色谱条件相同，设定不同检测器温度，分别为：200、210、220、230、240和250℃。考察不同检测器温度对色谱图的影响，从图3可以看出，除230℃外，从200~250℃，随着检测器温度升高，响应呈先上升后趋于平稳，240℃时略大于220℃，因此，选择240℃作为检测器的最佳温度。 图3.不同检测器温度 4))不同升温速率的优化 同上，初始柱温为60℃，进样口温度为240℃，检测器温度为240℃，其他气相色谱条件相同，设定不同升温速率，分别为：15、20和25℃/min。考察不同升温速率对色谱图的影响，从图4可以看出，峰高顺序是25>20>15，所以选择升温速率为25℃/min。 图4.不同升温速率 综上所述，初始柱温为60℃、进样口温度为240℃、升温速率为25℃/min、FID检测器温度为240℃。 图5.标准溶液色谱图 (磷酸三丙酯为125ug/mL，磷酸三丁酯浓度为150pg/mL) 图6.添加溶液色谱图 (磷酸三丙酯为125pg/mL，磷酸三丁酯浓度为150pg/mL) 图7.空白色谱图 (磷酸三丙酯为125ug/mL，磷酸三丁酯浓度为Oug/mL) 图8.样品色谱图 线性、检出限及RSD 配置标准溶液工作曲线，各浓度分别为：75.0、150.0、300.0、450.0和600.0 ug/mL， 内标浓度为125ug/mL， 考察组分的线性。实验结果表明TBP在75.0~600.0pg/mL线性关系良好，相关系数0.9998，标准工作曲线见图7。对75.0pg/mL标准品连续进样6针，RSD在1.14之间，重复性良好。该方法中仪器检出限为7.50ug/mL (S/N>10)(见表1)。 表1.线性及检出限数据 化合物 线性范围 相关系数 检出限 RSD (pg/mL) (pg/mL) (%) TBP 75~600 0.9998 7.50 1.14 加标回收率实验 加标回收率实验，添加量分别为75.0、150.0、300.0pg/mL，三水平6平行进行测试。实验结果表明加标回收率在81.43~100.20%之间，符合分析检测的要求(表2)。 图9.标准工作曲线 结论 本文基于文献报道和药典方法《中国药典》2010年版第三部附录VJ“磷酸三丁酯残留量测定法”。建立以毛细管色谱柱TG-WAXMS(30mx0.25mm×0.25um)分析血液制品中磷酸三丁酯气相色谱法测定条件，优化了初始柱温、升温速率、进样口温度和检测器温度。最佳色谱条件为：初始柱温为60℃、进样口温度为240℃、升温速率为25℃/min、FID检测器温度为240℃。实验结果表明TBP在75.0~600.0 pg/mL线性关系良好，相关系数0.9998，对75.0pg/mL标准品连续进样6针， RSD值为1.14%，重复性良好。该方法中仪器检出限为7.50 pg/mL(S/N>10)。加标回率率实验，添加量分别为75.0、150.0、300 .0pg/mL， 三水平6平行进行测试，实验结果表明加标回收率在81.43~100.20%之间，符合分析检测的要求。 表2.加标回收实验结果 添加浓度 回收率(%) 平均值 相对标 (pg/mL) 1 2 3 4 5 6 准偏差 75 87.98 94.69 81.43 90.89 92.49 86.14 88.94 5.38 150 100.10 94.22 94.22 100.20 92.77 94.24 95.96 3.43 300 95.63 93.46 99.97 94.98 96.04 98.27 96.39 2.44 ( [1] 吴骥宇，曹文，陈睿，刘惠军.毛细管气相色谱法测定糜蛋白酶中磷酸三丁酯残留量[J]，中国临床药学杂 志，2013，06. ) ( [2]刘婷婷，徐琛，陈益乐，等.气相色谱法测定医用纤维蛋白胶制品中磷酸三丁酯残留量[J]，中国临床药学 杂志，2011，04. ) ( [3]王伟，陈智岩.气相色法法测定冻干纤维蛋白胶制品中磷酸三丁酯残留量[J]，黑龙江中医药，2009. ) ( [4]盛凤仙.冻干人纤维蛋白胶制品中磷酸三丁酯残留量的气相色谱法测定[J]，中国医药工业杂 志，2002，03. ) ( [5]王传化.气相色谱校正曲线法快速测定磷酸三丁酯 含量[J]，磷肥与复肥，2013，06. ) ( [6]易勇，刘克清，张浩，等.气相色谱-质谱法分析固井 水泥浆添加剂中磷酸三丁酯[J]，分析仪器，2014，04. ) ( [7] GB/T15354-2011化学试剂磷酸三丁酯. ) ( [8]2010中国药典第三部附录VJ“磷酸三丁酯残留 量测定法”. ) 免费服务热线：88008105118 ThermoFisherSCIENTIFIC 支持手机用户) 本文基于文献报道和药典方法《中国药典》2010年 版第三部附录VI J“磷酸三丁酯残留量测定法”。建立以 毛细管色谱柱TG-WAXMS（30 m×0.25 mm×0.25 μm） 分析血液制品中磷酸三丁酯气相色谱法测定条件，优 化了初始柱温、升温速率、进样口温度和检测器温 度。最佳色谱条件为：初始柱温为60 ℃、进样口温度 为240 ℃、升温速率为25 ℃/min、FID检测器温度为 240 ℃。实验结果表明TBP在75.0～600.0 μg/mL线性关 系良好，相关系数0.9998，对75.0 μg/mL标准品连续进 样6针，RSD值为1.14%，重复性良好。该方法中仪器检 出限为7.50 μg/mL（S/N>10）。加标回收率实验，添加 量分别为75.0、150.0、300 .0 μg/mL，三水平6平行进 行测试，实验结果表明加标回收率在81.43～100.20%之 间，符合分析检测的要求。