T 细胞中分化、活化、衰竭和通过脱颗粒及细胞因子的表达分析其功能检测方案(流式细胞仪)

应用简报 Agilent细胞分析 Trusted Answers 在NovoCyte Advanteon 流式细胞仪上使用16色免疫表型分析 Panel 对激活后的Ｔ细胞状态进行全面分析 Lauren Jachimowicz， Ming Lei， Peifang Ye， Yan Lu 和 Garret Guenther 安捷伦科技有限公司 T细胞是免疫应答的重要组成部分，能够识别和清除外来病原体和肿瘤细胞。然而，为了防止产生自身免疫和免疫病理学问题，必须严格控制T细胞应答。我们开发了一款用于 Agilent NovoCyte Advanteon 流式细胞仪的16色免疫表型分析 panel，可同时分析Ｔ细胞的分化、活化、衰竭和通过脱颗粒及细胞因子的表达分析其功能。理论上，这种方法可以全面分析T细胞在免疫应答中的功能。 前言 免疫系统的作用是在限制自身免疫的同时对抗病原体。T细胞是适应性免疫应答的重要组成部分，可以识别特定抗原并对抗感染。在正常的免疫应答中，T细胞被活化后，迅速进行分裂并消除所有被感染或癌变的细胞。通过T细胞受体(TCR)和协同刺激受体实现的激活必须与抑制性受体(如程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、淋巴细胞活化基因3 (LAG-3)和Ｔ细胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白3 (TIM-3))保持平衡。这是防止产生自身免疫和免疫病理学问题所必需的。 当T细胞受到持续性刺激时，抑制性受体的表达逐渐增加，T细胞的效应功能和增殖能力下降(T细胞衰竭)。在慢性感染或癌症中可能出现这种情况。免疫检查点抑制剂能够通过阻断作用逆转抑制性受体的表达，恢复Ｔ细胞的功能，改善临床上的抗肿瘤免疫功能，因此抑制性受体成为了癌症免疫治疗研究的热点。，T细胞的衰竭程度与多种抑制性受体的共表达密切相关，因此联合治疗有良好的应用前景，因为这样能够靶向多种抑制性受体，提高抗肿瘤免疫功能。单独分析T细胞抑制性受体的表达并不能全面了解T细胞的状态。检测其他过程(T细胞分化、活化、既往抗原暴露、脱颗粒和细胞因子产生)的标志物，可以提供更全面的信息。 许多研究已经确定了初始T细胞、效应T细胞和记忆T细胞亚群中抑制性受体表达的固有差异。16色免疫表型分析 panel设计用于 NovoCyte Advanteon 流式细胞仪(表1)，用以检测 CD4T 细胞和 CD8T细胞的分化和活化状态，并检测功能性T细胞应答。利用 NovoCyte Advanteon流式细胞仪的高通量可以进行多参数分析，这些数据全面展示了活化后T细胞亚群的动态变化和功能。 深入分析 TCR 激活后的T细胞状态 为了全面研究T细胞对 TCR激活的反应，我们考察了 CD4T 细胞和 CD8T细胞的分化、活化和抑制剂标志物，，1以及脱颗粒和产生的细胞因子(表1)。用 anti-CD3 抗体、anti-CD28抗体和白细胞介素-2(IL-2)刺激分离的外周血单个核细胞 (PBMC)，诱导T细胞活化。在进行流式细胞分析的 前6小时，使用蛋白转运抑制剂阻断细胞因子的分泌。在刺激2天和4天后对样品进行初始检测，第4天再次刺激细胞，24I小时后分析(第5天)。 图1展示了第4天样品检测的代表性设门策略。首先，使用死活染料排除死亡细胞，然后检测整个 CD3T细胞群中 CD4T细胞和 CD8T细胞的频率。接下来，根据CD45RA 和 CCR7 的细胞膜表面表达确定T细胞亚群的相对频率，评估Ｔ细胞的分化。将T细胞分为初始样T细胞 Tnaive like(CD45RA+/CCR7+)、中枢记忆T细胞TcM (CD45RA-/CCR7+)、效应记忆Ｔ细胞TEM (CD45RA-/CCR7-) 和 CD45RA+效应记忆T细胞 TEMRA (CD45RA+/CCR7+)。通过记忆性干细胞样T细胞(TscM)上表达的CD95， 将 Tnaive-like 细胞分为真正的初始T细胞 (Tnaive) 和TscMo 标志物 荧光染料 克隆 用途 死活鉴定染料 AVID 活力 CD3 BV570 UCHT1 谱系 CD4 PerCP-Cy5.5 RPA-T4 CD8 BV785 SK1 CD45RA APC-Cy7 HI100 活化/分化 CCR7 PE-Cy7 G043H7 CD25 BV421 M-A251 CD127 PE-Cy5 A019D5 CD95 PE-Dazzle594 DX2 PD-1 APC EH12.2H7 抑制性受体 TIM-3 PE F38-2E2 LAG-3 BV605 11C3C65 IL-2 FITC MQ1-17H12 细胞因子 IFN-y AF700 B27 TNF-a BV650 MAb11 CD107a BV711 H4A3 脱颗粒 然后检测抑制性受体 PD-1、、TIM-3、LAG-3的表达以及活化标志物 CD25 和CD127。这些标志物能够提供更多有关T 细胞活化状态的信息。最后，检测产生的细胞因子IL-2、肿瘤坏死因子 a (TNFa)和干扰素Y(IFNy)， 以及通过 CD107a 的表达检测脱颗粒，分辨细胞毒性T细胞。使用荧光减一 (fluorescence minus one， FMO) 对照确定所有的门(图1D)。刺激4天后，大多数Ｔ细胞被活化， CD4和CD8T细胞群中不再含有 Tnaive 细胞。在T细胞中， CD25 表达大幅上调， CD127表达下调，与高度活化的T细胞一致。CD4 和 CD8T细胞的抑制性受体表达均上调，但并非所有细胞都呈现阳性表达。研究结果表明产生了细胞因子TNFa 和 IFNy，但观察到只产生少量IL-2。大多数Ｔ细胞也呈现 CD107a 阳性，表明它们已经具备细胞杀伤潜力。在 NovoCyteAdvanteon 流式细胞仪上使用该多参数染色 panel 可以对刺激后的T细胞进行全面分析。接下来，检测 TCR 激活后T细胞参数的动态变化。 图1.使用16色流式细胞分析 panel 检测刺激后的 PBMC 的免疫表型。使用5 pg /mL anti-CD3 抗体、2 pg /mL anti-CD28 抗体和 100 ng/mL IL-2刺激从供体血液分离的 PBMC。第4天用16色免疫表型分析 panel (表1)对刺激后的 PBMC 染色。在分析前6个小时将蛋白转运抑制剂混合物(2pL/孔)和 anti-CD107α BV711 抗体(5 uL/mL)直接添加到孔内。(A)设门策略。使用 FSC-H 和 SSC-H从碎片中识别靶细胞；使用死活细胞染料排除死细胞。使用CD3鉴定T细胞。随后对 CD3+细胞设门，识别 CD4+和 CD8+T细胞。对 CD4+或 CD8+细胞设门后，根据 CD45RA 和 CCR7 的差异表达， 对 TcM丶 TEM 和 TEMRA 细胞进行鉴定。从 CD45RA+CCR7+亚群中，进一步检测到 CD95+ TscM 和 CD95-初始T细胞(B)。还检测了 CD4+和 CD8+T细胞亚群中CD25 和 CD127的表达水平， PD-1、LAG-3和TIM-3的耗竭水平， IL-2、TNF-a 和 IFN-y 细胞因子分泌水平以及CD107a脱颗粒水平。此处展示的数据来自于第4天采集的样品。(B) FMO 对照。使用 FMO 对照确定门。PD-1、TIM-3、LAG-3和 CD107a 的FMO对照如上所示。在 Agilent NovoCyte Advanteon 流式细胞仪上获得样品结果，使用NovoExpress 软件进行分析 经刺激后T细胞分化状态持续变化 TCR激活引起T细胞分化的快速变化。通过鉴别每个亚群 (Tnaivey、TTscMTcMxTEM 和TEMRA) 来考察分化状态，如前一节所述。之前的研究已经确定了Ｔ细胞亚群之间的功能差异： Tnaive 和TcM 具有强增殖能力，但缺乏快速的效应功能，而TEM 和TEMRA 的增殖能力较弱，但效应功能范围较广。。 TscM 经历了抗原刺激， 但仍与 Tnaive 细胞一样保持了类似干细胞的自我更新特性。为了了解刺激后Ｔ细胞分化的变化，检测了未刺激的 PBMC和刺激2天和4天后 PBMC 中所有T细胞亚群的相对频率，并在第4天再次刺激 PBMC， 24小时后(第5天)进行检测(图2)。与预期一样，TCR 刺激2天后 Tnaive细胞的频率显著降低；大多数 CD45RA+ CCR7+细胞是 TscM， 因为 它们也表达 CD95(图2B)。这是使用anti-CD3/anti-CD28 抗体进行体外活化的典型现象，因为它应该激活所有存在的Ｔ细胞。刺激后， TcM 比例随时间稳定增加，而再次刺激后，，7TcM 比例下降(第5天的样品)。这表明再次刺激诱导T细胞向效应表型转变。总的来说，体外刺激PBMC 可诱导Ｔ细胞迅速分化为多个效应细胞和记忆细胞亚群。 图2.T细胞亚群的动态变化是连续性的。使用 5 pg/mL anti-CD3 抗体、2 pg/mL anti-CD28 抗体、100 ng/mL IL-2刺激从供体血液中分离的 PBMC。分别于第0天、第2天、第4天用16色免疫表型分析 panel (表1)对刺激后的 PBMC 染色。第4天再次刺激细胞，24小时后分析(第5天)。在各时间点分析 CD8T细胞(A)和CD4T细胞(B)中 CCR7 和 CD45RA的表达，以确定T细胞亚群(初始样、中枢记忆 (CM)、效应记忆 (EM)、CD45RA+效应记忆 (EMRA)T细胞)的相对变化。进一步分析 CD8 和 CD4初始样T细胞中CD95的表达，以区分记忆性干细胞样T细胞和真正的初始T细胞。 CD4+T细胞、CD8+T细十与 TscM、 TcM TEMs TEMRA Tnaive细胞的比例随时间而变化 TCR刺激后抑制性受体的表达逐渐上调持续的刺激使抑制性受体表达增加，这是T细胞衰竭的关键指标。抑制性受体的有效负调控有助于抑制过度的免疫应答。然而，抑制性受体也会阻碍清除病原体和肿瘤的有效免疫应答。确定抑制性受体在急性和持续性T细胞刺激时如何上调，对于针对这些通路开发更安全、更有效的治疗干预方案至关重要。 分别在第0天、第2天、第4天和再刺激后第5天检测活化标志物 (CD25 和CD127)和抑制性受体(PD-1、LAG-3 和TIM-3)(图3)。在CD8T细胞和CD4T细胞中， CD25 快速上调， CD127 下调，表明T细胞快速活化。刺激2天后，抑制性受体的表达没有立即发生变化。然而，刺激4天后， CD4和 CD8T细胞群中的 PD-1、LAG-3 和 TIM-3均上调。使用 anti-CD3/CD28再刺激，第5天时所 有抑制性受体均下调。与此同时，再刺激后 CCR7 表达下降，TcM 细胞百分比下降。随着Ｔ细胞向效应表型转变，减少抑制性受体表达是有益的。这与之前的研究相关联，之前的研究表明，T细胞衰竭发生在细胞向记忆表型转化的过程中，尽管抗原持续存在。在各种T细胞表型和功能背景下检测抑制性受体的表达，可以了解T细胞在免疫应答时是如何变化的。 图3.刺激后抑制性受体和激活受体表达水平的变化。使用 5 ug/mL anti-CD3 抗体、2 pg/mL anti-CD28 抗体、100 ng/mL IL-2刺激从供体血液中分离的 PBMC。分别于第0天、第2天、第4天用16色免疫表型分析 panel (表1)对刺激后的 PBMC 染色。第4天再次刺激细胞，24小时后分析(第5天)。分析了抑制性受体 PD-1、LAG-3、TIM-3及活化标志物 CD25、CD127随时间的变化 ( 通过同时考察T细胞分化、活化、细胞因子的产生和脱颗粒等过程对Ｔ细胞进行深入分析，进一步了解T细胞应答，从而实现了对T细胞更全面的了解。在 NovoCyte Advanteon 流式细胞仪上使用16色免疫表型分析 panel可以帮助进一步阐明T细 胞在持续感染和肿瘤免疫环境中的应答。 ) ( 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