成品药和原料药中五种亚硝胺杂质检测方案(气相色谱仪)

应用简报 Agilent制药与生物制药 Trusted Answers 使用安捷伦 GC/MS/MS仪器分析成品药和原料药中的五种亚硝胺杂质 Soma Dasgupta，Lalith Hansoge，Vivek Dhyani， Samir Vyas，Melissa Churlev ( 安捷伦科技有限公司 ) 本应用简报重点介绍了一种将 Agilent 7890B 或 8890 GC 与 Angilent 7010B 三重四极杆 GC/MS 系统联用，测定并估算沙坦类成品药和原料药中5种痕量亚硝胺杂质(NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA 和 NDBA) 的全面解决方案。7010B三重四极杆GC/MS 配备高效离子源(HES)， 可提供出色的灵敏度、重现性和精密度，性能远超法规限值的要求。该方法可达到的定量限 (LOQs) 仅为当前法规要求的1/20-1/2。 前言 从2018年7月开始， FDA 宣布召回缬沙坦，因为这种药物中含有N-亚硝基二甲胺(NDMA)。对所有制造商的血管紧张素受体阻滞剂 (ARB)类活性药物成分 (API)和成品药的后续调查也导致了缬沙坦、厄贝沙坦和氯沙坦被额外召回。已发现这些药品中含有 NDMA 和N-亚硝基二乙胺(NDEA)， 两者均为已知动物致癌物和疑似人类致癌物。 随后，N-亚硝基异丙胺(NEIPA)、N-亚硝基二异丙胺 (NDIPA)、N-亚硝基二丁胺 (NDBA)和N-亚硝基甲基-4-氨基丁酸(NMBA) 等其他杂质均被标记为潜在的亚硝胺杂质。迄今为止，1100多个不同批次的沙坦类药物(缬沙坦、氯沙坦和厄贝沙坦)已被召回，因为其中所含的这些杂质已超过了临时限值。 FDA 检测与研究办公室(OTR)发布了这几种杂质的几种分析方法，其中最新方法使用单四极杆 GC/MS与顶空进样分析4种杂质，以及使用三重四极杆 GC/MS/MS与液体进样分析5种杂质。单四极杆 MS的检测结果常常不准确，且灵敏度较低。相比之下，GC/MS/MS 更容易在这类情形下获得特异性，比 GC/MS 方法更合适。 我们将7890B或8890 GC 与7010BGC/MS/MS联用，使用 OTR 方法进行分析，发现两种系统对5种杂质均表现出出色的性能。HES 具有更高的电离效率，产生的离子数量增加了20倍，可实现可靠的痕量分析。8890 GC 由触摸屏界面而非键盘来控制，可实现诊断测试、系统监测预警和远程访问。 样品前处理 本次分析测试的 APls 和成品药包括缬沙坦、奥美沙坦、厄贝沙坦和氯沙坦。准确称量500 mg API， 加入15mL 一次性玻璃离心管中，并用移液管加入5mL内标溶液(约50 ng/mL NDMA：C13-d，的二氯甲烷溶液)。某些沙坦类药物(如缬沙坦和奥美沙坦)完全溶于二氯甲烷，而另一些(例如厄贝沙坦)则形成浑浊溶液或不可溶。将这些样品涡旋振荡1分钟，然后放入离心机中，以4000 rpm 的转速离心2.5分钟。使用一次性移液器，将约2mL二氯甲烷层通过 0.45 pm 尼龙过滤器过滤，然后转移至 GC 样品瓶中待分析。 标样前处理 适当稀释标样储备液，获得以下浓度的校准溶液：100、80、40、20、10、5、2.5 ng/mL， 每份溶液均用二氯甲烷配制，其中含 NDMA：C13-d。作为内标。 仪器 使用配备 Agilent 7693A 自动液体进样器的 Agilent 7890B 或 8890 GC 与 Agilent7010B三重四极杆 GC/MS 的联用系统进行分析。气相色谱仪配置 7697A J空进样器，连接到多模式进样口(MMI)。从进样口端，将一根尺寸为30mx0.25mm，1.0pm 的Agilent J&W VF-WAXms 毛细管气相色谱柱连接到MS。 表1和表2显示了 GC 和 MS 参数。 表1.气相色谱参数 参数 值 MMI 进样模式 脉冲不分流： 12.285 psi 持续0.5 min 进样口温度 250°C 柱温箱升温程序 40°C (0.5min) 以20°C/min 升至 200℃ (0 min)以 60°℃/min 升至250 ℃ (3 min) 总运行时间 12.33 min MS 传输线温度 250°C 进样量 2pL 载气 氦气， 1mL/min MS 采集方法使用 OTR 方法中的 MRM 采集数据。 表2.质谱参数 化合物间达到了足够的分离度，目标峰与溶剂和基质峰也充分分离。所有5种化合物的保留时间均与 FDA 法规中所提供的数据保持一致(图1和图2)。 使用线性拟合绘制校准曲线。 FDA 要求相关系数(R)≥0.998。本研究的所有5种杂质均获得了出色的线性， R²>0.999，如图 3A (7890B GC) 和图 3B(8890 GC)所示。 参数 值 模式 电子电离，40eV 离子源温度 250°C 四极杆温度 Q1和Q2=150℃ MRM模式条件 MS1 分辨率 所有化合物 Unit MS2分辨率 所有化合物Unit 碰撞气体流速 氮气， 1.5mL/min 淬灭气体流速 氦气， 4mL/min 检测器增益 1 定量/定性离子对(FDA方法) 开始时间：6.5min NDMA 74→ 44， CE 15V， 驻留 150ms 74→42， CE 20V， 驻留 50msNDMA：C13-d，82→48， CE 20V， 驻留100 ms 开始时间：7.60 min NDEA 102→85， CE10V， 驻留150 ms102→56， CE18V， 驻留 150 ms 开始时间：8.03min NEIPA 116→99， CE 10V， 驻留 150 ms71→56， CE 10V， 驻留 150 ms 开始时间： 8.25 min NDIPA 130→88， CE 10 V， 驻留 150 ms130→42， CE 10V， 驻留 150 ms 开始时间： 8.70 min NDBA 158→99， CE 10V， 驻留 150 ms84→56， CE 22V， 驻留150ms ×104+EIMRM CID@10.0 (158.0->99.0) 2，5ng_mL_001.D 图1.二氯甲烷中5种杂质在7个校准浓度下的 MRM TIC 叠加色谱图(Agilent 8890 GC) 图2.5种杂质的二氯甲烷混合溶液中最低浓度校准标样(2.5ng/mL)的提取 MRM色谱图(定量离子对) (Agilent 7890B GC) ×101. ×101. NDMA 221y=12.104634*x+0.014173 R2=0.99987833 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 相对浓度 图 3A. 使用 Agilent 7890B GC 获得的5种亚杂胺杂质的校准曲线 ×10 图 3B. 使用 Agilent 8890 GC 获得的5种亚硝胺杂质的校准曲线 经过验证的 FDA-OTR 方法要求 40 ng/mL标样6次重复进样的%RSD≤ 5。我们在研究中检验了 40 ng/mL 标样的重现性，所有5种杂质获得的%RSDs均<2(6次重复进样)，如表3所示。 OTR方法将10的信噪比 (S/N) 作为 LOQ的测定基准。在本研究中，以 FDA LOQs建议浓度加标的样品，其S/N 值远高于方法要求，表明仪器能轻松满足灵敏度要求并达到更低的 LOQs， 从而实现超痕量检测。FDA 规定的成品LOQs 以及本研究获得的 LOQs 如表4所示。LOQ水平下样品中杂质的色谱图示例以及 S/N 计算值如图4所示。 表3.40 ng/mL 亚硝胺杂质的峰面积和%RSD 值(Agilent 8890 GC) 类型 名称 NDMA峰面积NDEA 峰面积 NEIPA 峰面只 NDIPA 峰面积 NDBA峰面积 标样 STD3_001.D 134044.10 57894.56 151634.00 106545.00 43152.93 标样 STD3_002.D 130975.10 57019.84 147810.80 104067.40 42709.92 标样 STD3_003.D 131357.00 56826.24 149615.50 104264.10 42613.02 标样 STD3_004.D 134631.90 57973.19 152279.80 106116.10 43753.81 标样 STD3_005.D 132140.20 57361.97 149922.00 105469.30 43118.18 标样 STD3_006.D 131370.50 57048.14 149667.10 103762.50 42816.16 RSD (%) 1.17 0.84 1.07 1.11 0.97 表4.FDA方法规定的成品药 LOQs 及本研究获得的LOQs (Agilent 7890B GC) 杂质 FDA LOQ (ppm) LOQ (获得， ppm) 改善因子 NDMA 0.008 0.0025 >3 NDEA 0.005 0.0005 10 NEIPA 0.005 0.00025 20 NDIPA 0.005 0.0025 2 NDBA 0.025 0.008 >3 ×103 +MRM(74.0→42.0) 0.8 ng/mL ×102+MRM (102.0→85.0) 0.5 ng/mL 采集时间 (min) 图 4.以 FDA LOQs建议浓度加标的样品 S/N 值 (Agilent 7890B GC) ( 7890B-7010B 和8890-7010B GC/MS/MS 联用系统对所有5种亚硝胺药物杂质均 表现出相似的出色性能。8890 GC 可实现诊断测试、系统监测预警以及触摸屏控制和远程访问。7010B三重四极杆 GC/MS 的设计包含 HES， 与 7 890B 和 8890 GC 提供的惰性样品流路结合后，可降低痕量 杂质的检测限。这些特性使系统对所有5种残留实现了可靠定量。改进的 LOQs仅为建议水平的1/20-1/2，可在不更改方法参数的前提下进行高灵敏度分析。 ) ( 1. h ttps：//www.fda.gov/media/123409/ download ) ( 2. h ttps：//www.fda.gov/drugs/drug-safety-and-availability/search-list-recalled-angiotensin-ii-receptor-blockers-arbs-including-valsartan- losartan-and ) www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com DE.6920601852 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 本应用重点介绍了一种将 Agilent 7890B 或 8890 GC 与 Angilent 7010B 三重四极杆 GC/MS 系统联用，测定并估算沙坦类成品药和原料药中 5 种痕量亚硝胺杂质（NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA 和 NDBA）的全面解决方案。7010B 三重四极杆GC/MS 配备高效离子源 (HES)，可提供出色的灵敏度、重现性和精密度，性能远超法规限值的要求。该方法可达到的定量限 (LOQs) 仅为当前法规要求的1/20–1/2。