血浆中雌二醇和睾酮检测方案(液相色谱仪)

液相色谱分析方法 采用 TSQ Altis 三重四极杆液质联用仪在临床研究中定量分析血浆中雌二醇和睾酮 作者 目的 thermoscientific Xiaolei Xie， Kristine Van Natta， NeloniWijeratne， Claudia MartinsThermo Fisher Scientific， 圣何塞，加利福尼亚 采用液相色谱与三重四极杆质谱联用技术，为用于临床研究血浆中雌二醇和睾酮的定量分析，开发灵敏的 LC-MS/MS 分析方法。 简介 对用于临床研究血浆样品中雌二醇和睾酮的定量分析要求具有灵敏的分析方法。液相色谱与串联质谱联用(LC-MS/MS)技术因其是一种高灵敏度和宽选择性的分析技术，现已被广泛用于对复杂基质样品的雌二醇和睾酮的分析中，如人体血清或血浆。 实验 样品制备 为制备样品，先将10 pL 的加标溶液(最终浓度范围：0.5-10 ng/mL)和20 pL的内标化合物(2 ng/mL 睾酮-13C3 和20 ng/mL 雌二醇-d5)加入到 400 uL 的血浆中。然后再加入2 mL 的 MTBE， 对样品溶液进行涡旋。在进行液-液萃取(LLE)之之对 MTBE 层进行氮吹，氮吹后加入200 uL 50： 50甲醇/水重新建立分层。取 10 uL 进样进行 LC-MS/MS分析，每个样重复进样三次。 采用 Thermo ScientificMVanquishTM Flex HPLC 系统并配备 Thermo ScientificM AccucoreM aQ C18极性 LC色谱柱(100×2.1 mm， 2.5 um 粒径， P/N 17326-102130)进行色谱分离。流动相A和B分别为 0.5mM的氟化铵水溶液和纯甲醇溶液，溶剂分别为 Fisher ChemicalMOptimaM 级水和纯甲醇。柱温箱温度设为40°C，总运行时间为9分钟(表1)。 表1.LC梯度洗脱条件 编号 时间(min) 流速(mL/min) %B 曲线 1 0 0.25 30 5 2 1 0.25 30 5 3 1.5 0.25 55 5 4 5 0.25 85 5 5 6 0.25 100 5 6 7 0.25 100 5 7 7.01 0.25 30 5 8 9 0.25 30 5 质谱分析方法 质谱方法采用配置加热式电喷雾离子源(HESI)的Thermo ScientificM TSQ AltisM三重四极杆质谱仪进行分析。表2显示了质谱仪的离子源参数。 对雌二醇、睾酮及其同位素标记的内标化合物分析时采用选择反应监测(SRM)离子对，以提供离子比率确认(IRC)。在分时选择反应监测(t-SRM)模式下进行扫描，循环时间为0.4秒。表3显示了在本次分析中所使用的SRM 相关参数信息。 表 2. TSQ Altis 质谱仪的离子源参数 离子源参数 设置值 正离子 3500V 鞘气 40 Arb 辅助气 12 Arb 吹扫气 1 Arb 离子传输管温度 350℃ 雾化器温度 350℃ 采用 Thermo ScientificTM TraceFinderTM 软件进行数据采集和数据处理。 结果和讨论 雌二醇和睾酮的定量下限(LLOQ)被定义为根据线性校正曲线反算所得到的校正物浓度不超过理论值的20%、离子比率在目标物20%范围内，且重复进样计算所得的%RSD 小于20%时的最低浓度。血浆中睾酮的 LLOQ 为2 pg/mL-20 fg(线性范围为：2-1000 pg/mL-图1)，血浆中雌二醇的 LLOQ 为 20 pg/mL-200 fg(性性范围为：20-10，000 pg/mL-图2)。对于所有浓度重复进样的样品而言，睾酮和雌二醇的精密度分别小于 8%和7%。 化合物 保留时间(min) 保留时间窗口(min) 极性 母离子(m/z) 子离子(m/z) 碰撞能量(V) 射频透镜(V) 定量分析离子或确认离子 雌二醇 4.8 1 负离子 271.1 183.1 40 100 定量 雌二醇 4.8 1 负离子 271.1 145.1 40 100 确认 雌二醇-d5 4.8 1 负离子 276.1 187.1 41 100 定量 雌二醇-d5 4.8 1 负离子 276.1 147.1 38 100 确认 睾酮 4.9 1 正离子 289.1 109.1 25 51 定量 睾酮 4.9 1 正离子 289.1 97.1 22 51 确认 睾酮-13C3 4.9 1 正离子 292.3 112.1 25 51 定量 睾酮-13Cs 4.9 1 正离子 292.3 100.1 21 51 确认 B Plasma_Testosterone_2pGmL_01 Testosterone m/z： 109.100 RT 3.61 C RT： 3.61 D 睾酮-IS 平均面积：465474；%RSD=7.09 图1.睾酮数据：(A)校正曲线；(B)定量离子的 LLOQ色谱图； (C) 确认离子的LLOQ色谱图及(D)睾酮的内标化合物。 B HESI_E2_Cal-06_001 Estradiol m/z： 183.0710 C HESI_E2_Cal-06_001 EEstradiol m/z： 145.0400 图2.雌二醇数据：(A)校正曲线；(B)定量离子的 LLOQ色谱图； (C)确认离子的 LLOQ 色谱图及(D)雌二醇的内标化合物。 TSQ Altis 三重四极杆质谱仪为血浆中的雌二醇和睾酮的临床定量分析研究提供了卓越的灵敏度。 在该篇技术文摘所描述的方法中，当采用该方法测定血浆定的睾酮和雌二醇时，定量限分别为 20 pg/mL (柱上进样200fg) 和 2 pg/mL(柱上进样20fg)。 SCIENTIFIC 热线话ww.thermofisher.com口慧赛默飞色谱和质谱中国S CIENTIFIC 对用于临床研究血浆样品中雌二醇和睾酮的定量分析要求具有灵敏的分析方法。液相色谱与串联质谱联用（LC-MS/MS）技术因其是一种高灵敏度和宽选择性的分析技术，现已被广泛用于对复杂基质样品的雌二醇和睾酮的分析中，如人体血清或血浆。TSQ Altis 三重四极杆质谱仪为血浆中的雌二醇和睾酮的临床定量分析研究提供了卓越的灵敏度。在该篇技术文摘所描述的方法中，当采用该方法测定血浆中的睾酮和雌二醇时，定量限别为 20 pg/mL（柱上进样 200 fg）和 2 pg/mL（柱上进样 20 fg）。