牛奶中磺胺甲氧哒嗪检测方案(液相色谱柱)

引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 用固相萃取和液相色谱串联质谱法测定牛奶中的磺胺药物 应用报告制药 作者 摘要 ( Carol A. Gonzalez ， Karyn M. Usher 西切斯特大学化学系 West Chester， PA 19383 USA ) Anne E. Brooks， Ronald E. Majors Agilent 科技公司 2850 Centerville Road 本文研究了用 Agilent SampliQ 聚合型强阳离子交换 (SCX) 小柱固相萃取，对牛奶样品中9种痕量含氮磺胺药物(磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺噻唑，磺胺甲基嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪和磺胺二甲氧嘧啶)的提取。用 Agilent 6410三重串联四极杆LC/MS-MS 系统对磺胺药物进行了分离和测定。反相色谱分离采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus 色谱柱 (C18， 3.0 mm x50 mm， 1.8 pm)，用0.1%甲酸/乙腈梯度洗脱。牛奶样品的总回收率为73%到99%， %RSD 值低于10%。牛奶中各种磺胺药物的检测限为 0.2 ng/mL到 2.0 ng/mL(S/N=3)，低于美国食品与药品管理局规定牛奶中的容许量。 Wilmington， DE 19808 USA Agilent Technologies 前言 自从十九世纪初磺胺药物的抗菌活性被发现以后，一直被用来治疗各种疾病。乳品业中，获准可给奶牛服用磺胺药物用以防止感染。这就可能导致药物残留在牛奶中，并转嫁给消费者。这种摄取可能导致抗抗性，使这些药物今后在治疗疾病时失效[1，2]。 磺胺，一般称为磺胺药物，自1929年 Gerhard Domagk 发现以来，已经证明是有效的抗菌制剂。现在，虽然β-内酰胺类抗菌素在抗感染方面比磺胺更为通用，但由于磺胺价格低廉，在世界不同地区仍然很常用。多年以来，许多微生物已经对这类化合物出现了 抗药。人们越来越关注那些可能由动物带给人类的抗药菌。这些化合物抗药的一个主要原因，就是给动物服用了治疗疾病的低浓度抗菌药物。二十世纪九十年代，美国食品与药品管理局(FDA)开始对几种乳制品进行检测[3]。如果奶牛摄入了磺胺药物，牛奶中可能有低浓度的这类化合物，某些消费者可能因此产生过敏反应，还会增加抗药有机体的数量。本文报导了一种分析牛奶中9种重要磺胺药物的完整解决方案，这些药物包括：磺胺甲恶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪和磺胺二甲氧嘧啶(其结构和化学性质见图1)。 实验 材料和化学试剂 水(EMD化学试剂公司， Gibbstown，NJ)、乙腈和甲醇 (Burdickand Jackson， Muskegan，M) 均为 HPLC级。磺胺药物为分析纯，购自 Sigma-Aldrich (Saint Louis， MO)。储备溶液(~1.19 mg/mL)用25mL甲醇配制，最多冷藏保存14天。工作溶液每天配制，储备溶液加水稀释。 SPE 小柱是 Agilent SampliQ SCX， 3 mL/60 mg(部件号5982-3236)，，-一种平均粒度 30 um 的聚合型阳离子交换柱。分析采用Agilent 1200 系列 HPLC，与6410三重串联质谱仪联用，配置电喷雾离子源。分析柱是 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18， 3.0 mm×50mm， 1.8 pm (部件号959941-302)。用于流动相配制和沉淀牛奶中蛋白和脂质的甲酸购自 J.T. Baker (Phillipsburg， NJ) (BakerPCS试剂， 90%)。 品制备 每1mL全脂牛奶中加入20uL45%甲酸水溶液(通过将10mL90%甲酸和10mL水混合而配制)，沉淀蛋白和脂质。然后将牛奶样品在 8000 rpm 离心 10分钟 (Eppendorf 5810R 15 amp，Westbury，NY)。也可以在 3500 rpm 离心20分钟。取出一定量上清(制备的全脂牛奶提取物)，加载到 SampliQ SCX 小柱上。 SPE 净化 SPE 小柱按图2所述进行老化和平衡后，将5mL制备的全脂牛奶提取物加载到柱上。上样过程中应将流速控制在1.5 mL/min 之内。两个干燥步骤中，小柱均在规定时间内15mmHg真空下抽干。洗脱液用氮气吹干，再用1mL溶剂(9：1水：甲醇)复溶。将样品超声(Branson 1200， Danbury， CT) 5 分钟后，用 Agilent 6410三重串联四极杆LC/MS-MS 系统分析。 由于要分析的磺胺药物浓度很低，用 Agilent 6410三重串联四极杆LC/MS-MS系统可以得到非常低的检测限，所以一定要特别注意保持 SPE 多管真空系统的洁净，以防样品被污染。在使用间隙，必须彻底清洁多管真空系统，或者，在使用可选项时，用新更换的针头。 分离和分析 色谱和 MS/MS 实验设置如表1、2和3所示。 表1.HPLC设置 色谱柱 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，3.0×50 mm， 1.8 pm (部件号959941-302) 流速 0.42 mL/min 柱温 35°C 进样量 1.7 pLw/针头冲洗用甲醇/水(5：1)清洗冲洗口 30秒 流动相 A：水/乙腈(9：1)w/0.1%甲酸 B：乙腈w/ 0.1%甲酸 分析时间 8分钟 后运行时间 3分钟 梯度 时间 0 3.5 8 %B 0 表2. MS/MS条件 Te (min) 化合物 母离子 子离子 1.69 磺胺嘧啶 251.2 156.0 108.0 1.93 磺胺噻唑 256.1 156.0 108.0 2.41 磺胺甲基嘧啶 265.2 156.0 108.0 3.44 磺胺二甲基嘧啶 279.2 186.1 124.1 3.89 磺胺甲二唑 271.1 156.0 108.0 4.10 磺胺甲氧哒嗪 281.2 156.0 108.0 5.99 磺胺氯哒嗪 285.1 156.0 108.1 6.42 磺胺甲恶唑 254.2 156.1 108.1 7.17 磺胺二甲氧嘧啶 311.2 156.0 表3. 电喷雾离子源条件 气体温度 350°C 气体流速 12 L/min 喷雾器 40 psi 毛细管 4000V 结果和讨论 线性和检测限 向储备溶液中添加基质空白，配制建立外标校正曲线的溶液。基质空白通过将牛奶经前处理全过程而制备，包括沉淀、离心和SPE 步骤。校正曲线的结果列于表4。用回归结果计算回收率。选择各药物信噪比(S/N)大于 3：1处的浓度为检测限。检测限见表4. 表4. 磺胺药物的校正曲线回归分析 牛奶中的LOD 化合物 回归方程 R2 (ng/mL) 磺胺嘧啶 v=282.62x+225.59 1.0000 0.4 磺胺噻唑 v=440.38x+246.43 0.9996 1.0 磺胺甲基嘧啶 v=358.34x+485.54 0.9998 1.0 磺胺二甲基嘧啶 y=539.09x+576.81 0.9989 1.0 磺胺甲二唑 y=499.57x+333.03 0.9994 2.0 磺胺甲氧哒嗪 y=494.61x+139.66 0.9970 1.0 磺胺氯哒嗪 v=343.78x+92.808 0.9999 2.0 磺胺甲恶唑 v=260.05x-351.97 0.9901 2.0 磺胺二甲氧嘧啶 v=956.97x+1420.9 0.9973 0.2 回收率和重现性 用两个浓度测定方法的回收率和精密度，即，牛奶中的添加浓度为 5 ng/mL 和10 ng/mL。由于在 SPE 步骤中采用5mL制备的全脂牛奶提取物加载到 SPE 小柱上，并用1mL流动相复溶，所以被分析物的浓度是牛奶样品浓度的5倍。因此，加标5ng/mL的牛奶样品的分析物浓度为25ng/mL， 加标10ng/mL的牛奶样品的分析物浓度为50 ng/mL。每个浓度重复分析5次。回收率和重现性数据如表5所示。空白和加标牛奶提取物(5 ng/mL)的色谱图如图3所示。 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 表5. 本研究中所用9种磺胺药物的回收率和精密度 牛奶中加标浓度 RSD 化合物 (ng/mL) 回收率 (%) 磺胺嘧啶 5 74.2 8.3 10 99.7 5.7 磺胺噻唑 5 76.8 4.4 10 83.2 4.7 磺胺噻唑 5 73.2 6.3 10 84.8 0.6 磺胺二甲基嘧啶 5 78.3 7.5 10 89.0 3.1 磺胺二甲基嘧啶 5 78.4 7.0 10 94.5 5.3 磺胺甲氧哒嗪 5 76.3 6.2 10 86.9 2.2 磺胺氯哒嗪 5 78.3 9.4 10 84.3 6.0 磺胺甲恶唑 5 74.0 4.3 10 87.7 6.4 磺胺二甲氧嘧啶 5 75.4 3.1 10 82.5 5.4 结论 本研究结果表明， Agilent SampliQ SCX 小柱可以用于对复杂样品(如全脂牛奶)中多种磺胺药物进行有效的净化和富集。在 SPE 净化步骤后残留的杂质对这些磺胺药物的定量没有干扰。测定浓度低于 FDA 认为的牛奶中磺胺的安全浓度(10 ng/mL)。方法的LOD 也远远低于该浓度(牛奶中3ng/mL)。 ( 参考文献 ) ( 1. G. G . Khachatourians， Canadian Medical Association Journal， 159 (9) ： 1129，1998 ) ( 2. M. K. Glynn， C. Bopp， W. D ewitt， P. Dabney， M. Mokhtar，and F. J. Angulo， New England Journal of Medicine，Volume 338 (19)： 1333-1339， 1 998 ) 3.U.S.Food and Drug Administration Center for Food SafetyApplied Nutrition Food Compliance Program Chapter03-Foodborne Biological Hazards (10-01-97)http：//www.cfsan.fda.gov/~comm/cp03039.htmlaccessed 2/13/09 更多信息 如需了解有关我们产品和服务的更多信息，请访问我们的网站www.agilent.com/chem/cn。 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料中出现的错误，以及由于提供或使用本资料所造成的相关损失不承担责任。 本资料中涉及的信息、描述和规格，如有变更，恕不另行通告。 @安捷伦科技公司版权所有，2009年 中国印刷 2009年3月11日 出版号5990-3713CHCN Agilent Technologies