哺乳动物细胞培养上清液中lysine检测方案(液质联用仪)

岛津SHIMADZUSSL-CA14-317Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-242 咨询电话：021-22013542上海市淮海西路570号红坊E楼http：//www.shimadzu.com.cn 超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法同时测定人免疫细胞培养上清液中95种化合物 LCMSMS-242 摘要：：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四四杆质谱仪 LCMS-8050联用同时测定人免疫细胞培养上清液中95种化合物的方法。该方法在17 min 内成成95种化合物的分离，分析速度快、重复性好、灵敏度高，适合细胞培养上清液中糖类、氨基酸类、核苷酸类、维生素类和其他类影响因子等化合物的高灵敏度快速检测。 关键词：超高效液相色谱仪三重四极杆质谱仪免疫细胞培养上清液 适宜的培养基组成与优选的细胞培养工艺对于提高蛋白类药物的产率，保证细胞培养批次之间的一致性、稳定关键质量属性等因素至关重要。 目前生物过程工艺开发与优化偏重于检测常规的温度、搅拌、气体溶解量和OD值等理化条件以及少数培养成分与代谢物的变化，缺乏对于细胞上清液组组直接、全面和快速的客观动态数据分析，因此无法精准优化调整细胞培养工艺条件和培养基中各组分配比。为满足快速全面分析细胞培养上清液组分，将基础碳源、氮源、核苷酸、维生素和其他主要代谢物一起检测分析，得到 更多有关生物过程中的详细信息，我们开发出“细胞培养分析方法包”。该技术平台采用超高效液相色谱三重四极杆液质联用仪，仅需17分钟，即可同时监测分析下列95种细胞培养上清液营养成份和代谢物的相对丰度变化。 本文使用岛津超高效液相色相仪LC-30A 和三重四极杆质谱LCMS-8050联用，利用“细胞培养分析方法包”建立了人免疫细胞培养上清液中营养物质和细胞代谢物的液相色谱-串联质谱的同时分析方法，供相关人员参考。 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050联用系统。具体配置为： LC-30ADx2输液泵， DGU-20A，在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-20AC 柱温箱， CBM-20A 系统控制器，LCMS-8050 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.80 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件雾化气：氮气3.0L/min分析仪器： LC-30A系统干燥气：氮气15 L/min色谱柱：见“细胞培养分析方法包”加热气：空气10 L/min流动相：见“细胞培养分析方法包”碰撞气：氩气流速：0.35mL/min脱溶剂管温度：250℃进样体积：1pL加热模块温度：400℃木温： 40℃接口温度：300℃洗脱方式：梯度洗脱时间程序：见“细胞培养分析方法包”驻留时间：2.0-5.0 ms质谱条件 分析仪器： LCMS-8050 离子源：ESI， 正负离子同时扫描 离子源接口电压：+4.0kV； -3.0 kV 扫描模式：多反应监测(MRM) MRM参数：见“细胞培养分析方法包” 化合物：见表1 1.3免疫细胞培养相关信息 细胞：人免疫细胞 培养时间：13天 培养基：含血清培养基 培养工艺：每天加料 1.4数据处理 LabSolutions Traverse MS 1.5样品制备 样品前处理方法：取500pL细胞培养液，在室温下离心1分钟(3000 rpm)，吸取100 pL 离心后上清液到新的离心管中，然后加入20 pL2-异丙基苹果酸内标溶液(0.5mmol/L)，再加入200uL乙腈，涡旋使充分混匀，室温下离心15分钟(15000 rpm)，精密吸取上清液100 uL，加入900uL水，涡旋混匀，上机前再用纯水稀释100倍。 表11细胞培养方法包中96种化合物列表 结果讨论 2.1免疫细胞培养上清液分析色谱图 使用“细胞培养分析方法包”中的方法对人免疫细胞培养上清液中的组分进行分析，目标组分不同程度被检出，色谱图如图1所示。 图1人免疫细胞培养上清液(1d)分析色谱图 2.2在细胞培养过程中部分营养物质和代谢物质峰面积与内标峰面积比值变化趋势 在持续加料的培养过程中95种化合物检测取样点分别为 1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d、11d和13d。 2.2.1培养过程中部分糖类化合物相对含量变化情况(1-13d) 图2人免疫细胞在1-13d培养过程中部分糖类化合物相对含量变化情况 由图2可知3-6d 葡萄糖 (glucose) 的消耗最多，由此可判断免疫细胞在这段时间内生长比较旺盛，可考虑在这段时间适当增加加料量以补充细胞生长所需碳源。 2.2.2培养过程中部分氨基酸类化合物相对含量变化情变(1-13d) 图3人免疫细胞在1-13d培养过程中部分氨基酸类化合物相对含量变化情况 由图3可看出赖氨酸 (lysine)、蛋氨酸 (methionine)、丝氨酸 (serine) 和色氨酸 (tryptophan) 在 3-6d的相对含量最小，尤其是色氨酸在第 3d时相对含量几乎为零，由此可知这些氨基酸在 3-6d时消耗量最大，在过程加料时可考虑适当增加加料液中这些氨基酸的相对含量。 2.2.3培养过程中部分维生素类化合物相对含量变化情况(1-13d) LCMSMS-242 图4人免疫细胞在1-13d培养过程中部分维生素类化合物相对含量变化情况 由图4可知在1d-13d的培养过程中生物素(biotin)、胆碱(choline)、叶酸(folic acid) 的相对含量基本维持在一个浓度水平；在1-2d培养过程中吡哆醛 (pyridoxal) 的相对含量较低，培养后期基本维持在一个浓度水平，因此在培养过程加料时可考虑在 1-2d 培养期间内适当增加吡哆醛的投料量。 2.2.4培养过程中部分有机酸类化合物相对含量变化情况(1-13d) 图5)人免疫细胞在1-13d培养过程中部分有机酸化合物相对含量变化情况 由图5可知在1-3d培养过程中乳酸 (lactic acid) 的相对含量逐渐增大，由此可知在 1-3d培养过程中免疫细胞快速生长导致乳酸含量快速增加，在后期培养过程中基本维持在一个浓度水平；在1-13d的培养过程中苹果酸 (malicacid)、3-甲基-2-羟基戊酸(3-methyl-2-oxovaleric acid) 和柠檬酸(citric acid)的相对含量都很低，在持续加料的培养过程中没有明显变化趋势。 结论 采用岛津公司 LCMS-8050三重四极杆液质联用仪快速分析人免疫细胞上清液中95种营养物质和代谢物质在13天培养过程中(每天加料)的相对浓度变化情况，从而对人免疫细胞培养工艺提供可靠的参考依据。参考“细胞培养分析方法包”，该方法无需优化仪器参数，方法操作简单，结果直观。 ( 岛津全球应用技术开发支持中心 ) 采用岛津公司 LCMS-8050 三重四极杆液质联用仪快速分析哺乳动物细胞培养上清液中95种营养物质和代谢物质在13天培养过程中（每天加料）的相对浓度变化情况，从而对哺乳动物细胞培养工艺提供可靠的参考依据。参考“细胞培养分析方法包”，该方法无需优化仪器参数，方法操作简单，结果直观。