米托蒽醌分子印迹传感器中电化学性质检测方案(电化学工作站)

高等学校化学学报CHEM ICAL JOURNAL OF CHNESE UN VERSITISNo.71334~1338Vol 292008年7月 武五爱等：米托蒽醌分子印迹传感器的研究及其应用1335No. 7 米托蒽醌分子印迹传感器的研究及其应用 武五爱，尹志芬，尉景瑞，郭满栋 (山西师范大学化学系，临汾 041004) 摘要 在弱酸性条件下，以邻氨基酚为单体交联剂，米托蒽醌为模板分子，用循环环安法电聚合成米托托醌分子印迹聚邻氨基酚敏感膜传感器.该传感器对米托蒽醌具有良好的选择性和敏感度，米托蒽醌浓度分别在3.3×107~1.0 ×10mol/L及1.0×10-5~5.0×10~mol/L范围内与峰电流减小量呈线性关系，检测下限为1.6 ×10mol/L， 同时对分子印迹膜的结构和性能进行了研究. 关键词 分子印迹；米托蒽醌；传感器 中图分类号 0657 文献标识码 A 文章编号 0251-0790(2008)07-1334-05 分子印迹技术是将模板分子、功能单体、交联剂及引发剂在适当的溶剂中进行聚合得到固体聚合物，然后通过一定的手段除去模板分子，以便得到与模板分子空间结构及结合位点相匹配的分子印迹聚合物的技术.这项技术以其构效预定性、特异识别性和广泛实用性越来越受到人们的关注. 近年来，为适应药物分析、环境保护、基因检测及生命科学发展的需要，将功能分子以适当方式修饰到电极上，制备选择性好、灵敏度高、有一定寿命且可再生的生物传感器是分析工作者努力探索的课题. 米托蒽醌属于蒽环类抗癌药物，主要用于治疗乳腺癌和白血病.其细胞毒性与其它蒽类抗癌药物.相比有所降低，但仍然会引起骨髓抑制及心脏毒性等毒副作用刊.)目前对于米托蒽醌的测定方法使用很多，主要有高效液相色谱法去2~5]、分光光度法61、流动注射化学发光法、共振瑞利散射法8]及电化学方法19~12等.这些方法的建立为米托蒽醌的测定提供了一定手段，但由于这些方法有的选择性低，有的灵敏度不高或前处理繁琐、仪器价格昂贵而难以推广，因此有必要寻找一种有效、快速且廉价的检测方法. 本文以邻氨基酚为聚合单体，米托蒽醌为模板分子，在弱酸性溶液中，用循环伏安法在玻碳电极上电聚合得到无活性的米托蒽醌分子印迹电化学传感器.结果表明，该传感器不仅识别性能好，而且灵敏度高，易于重复制备，可用于药物分析中米托蒽醌的测定. 1 实验部分 1.1 试剂与仪器 邻氨基酚(OAP， 分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；米托蒽醌(上海医药工业研究所，配制成浓度为 1.0 ×10mol/L的储备溶液，于4℃避光保存，使用时逐级稀释)；其它试剂均为分析纯.实验用水为二次蒸馏水. LK98B Ⅱ型微机电化学分析系统[以直径为2mm的玻碳电极为工作电极，铂丝电极为辅助电极，Ag/AgC1(饱和KCl)电极为参比电极.天津兰力科化电子高技术有限公司1；KQ-50超声洗涤器(上海超声仪器厂)；扫描电子显微镜 SFM (X-650，日本日立公司). 1.2 实验方法 1.2.1 玻碳电极的处理 将玻碳电极用氧化铝粉抛光，在二次水和无水乙醇中分别超声洗涤 5min， ( 收稿日期：2008-04-10. ) ( 基金项目：山西省自然科学基金(批准号：20001057)资助. ) ( 联系人简介：郭满栋，男，教授，主要从事电分析化学研究. Email： g u omd@dns sxnu edu cn ) 并重复3次，然后进行电化学活化处理[即在 0.5mol/L的 HSO4中于 -0.3~1.5V进行循环伏安(CV)扫描]，直到获得稳定的循环伏安响应. 1.2.2 分子印迹聚合物膜的制备 电化学聚合采用传统的三电极体系进行，先称取0.2528g邻氨基酚(OAP)，用 0.1 mol/L的 HCD溶解，再用 0.4mol/L的 NaOH调节溶液的 pH至中性，定容至50mL，然后取9mL溶液，在其中加入1mL 1.00×10'mol/L米托蒽醌溶液.用循环伏安法扫描 30次，扫描范围-0.2~1.0V，扫描速度50mV/s 电聚合完成后，用0.5mol/L的 HSO溶液浸洗 10h后，用二次水淋洗 1min以除去模板分子，制成保留有米托蒽醌分子构型孔穴的分子印迹高分子膜. .在同样实验条件下，不加入米托蒽醌分子制备非印迹膜电极作比较. 2 结果与讨论 2. 1 分子印迹电聚合 图1为在模板分子米托蒽醌存在下，玻碳电极上邻氨基酚(OAP)电聚合过程中的循环伏安(CV) 曲线.由图311可看出，阳极峰电位(E)为0. 783V；由曲线的形状可以看出邻氨基酚(OAP)在玻碳电极上的电化学聚合是一个完全不可逆过程，随着扫描圈数的增加，峰电流明显下降，最后成为一直线，这表明形成的致密、非导电性聚合膜，逐渐覆盖在电极表面上，导致伏安响应受到抑制. 2.2分子印迹膜的结构形式探讨 由文献[13]可知，在酸性溶液中，邻氨基苯酚可电聚合形成均匀、致密的聚邻氨基 Fig 11(Cyclic voltamm ogram s of the electropolym er iza tionprocedure 苯酚膜(POAP)，该膜具有“张开"结构(见图2)，而米托蒽醌在溶液中将因溶液酸度的变化而有不同的存在形式.随着酸度的提高，分子中蒽环的两个羰基、两个亚氨基和烷链上的两个亚氨基会逐渐质子化而形成+1价至+6价的阳离子1，推测分子印迹膜中有有氢形成. Fig 2 Structure of POAP m embrane 米托蒽醌分子可以用 0.5mol/L的 H， SO溶液洗脱.在强酸性溶液中，由于导致分子印迹敏感膜的氢键作用而被破坏，米托蒽醌分子可从分子印迹敏感膜立体孔穴中逸出；而在含米托蒽醌的测试溶液{本文用4.0 ×10 mol/L的K [Fe(CN)}中，米托蒽醌分子又可通过建键作用进入分子印迹敏每膜中，从而引起铁氰化钾峰电流响应的变化，其印迹过程见图3. Fig 3 Illustration of i printed site 2. 3 分子印迹膜的表征 采用循环伏安法(CV)表征膜的特性，控制扫描速率为50mV/s， 结果如图4所示.图4中曲线a是在4.0 ×10mol/L的 K[Fe(CN)溶液中， Fe(CN)3+离子在裸玻碳电极表面发生电化学还原反 应的循环伏安图，图4曲线b是在相同条件下电聚合修饰后的玻碳电极表面发生电化学还原反应的循环伏安图，两者差异显著，说明该膜是致密绝缘的. 对洗脱模板分子后的印迹膜进行了扫描电镜分析，结果见图5，其中图5(A)为聚合物放大500倍的SEM图，图5(B)为聚合物被放大1.5万倍时的SEM图.由图5可以看出，聚合物印迹膜表面形成了许多不规则的孔穴. Fig 4CCyclic voltamm ogram s of the electrodes inK[Fe(CN)6] solution a Bare eletrode； h electrode modified with electropolymer Fig 5 SEM photographs ofmolecuarly in printed film 2.4 分子印迹效应 采用比循环伏安法更灵敏的差分脉冲法(电位范围-0.2~0.5V，电位增量 5mV，脉冲幅度50mV，脉冲宽度5s，脉冲间隔0.1s)对印迹效应进行评价，结果见图6. 在 4.0 X10mol/L的 K[Fe(CN)，溶液中加入模板分子米托蒽醌后，修饰了未进行洗脱的印迹膜和非印迹膜的玻碳电极对米托蒽醌没有响应(图6曲线c和d)；而洗掉模板分子的印迹膜对米托蒽醌有良好的响应，在0.185V处 K[Fe(CN)峰电流值明显下降，即加入米托蒽醌前峰电流为37.82uA(图6曲线a)，加入1.0×10mol/L米托蒽醌后，峰电流值为26.86uA(图6曲线b). 上述结果表明，实现分子印迹后所得的膜保留了具有对模板分子米托蒽醌识别的三维孔穴，使K[Fe(CN)]分子可通过孔穴扩散至玻碳电极表面，发生电化学还原反应，而当溶液中米托蒽醌分子进入印迹孔穴后，孔穴封闭， Fe(CN)扩散受阻，玻碳电极表面的Fe(CN)，浓度减小，从而使还原电流减小. 2.5 印迹敏感膜电极的选择 Fig 6 D ifferental pulse voltammmetric responses ofthe electrodes in 4 x10mol/L K[Fe(CN)solution a. Curve of elecrtopolymer electrode of o-am inophenolwhich removedtemp late molecule； h curve of elecrtopolymer electrode of o-am ino-phenol which removed temp late molecule in 4. 0 ×10-3 mol/LK[Fe(CN)6] solution containing 1. 0 × 10-5 mol/L MTX；.c curve of elertopolymer electrode of o-aminophenol containningtemp late molecule；d.d.curve of elertopolymer electrode of o-amino-phenol 为验证敏感膜内的识别位点只对米托蒽醌这一印迹分子有特殊选择性的特点，采用一些结构与米托蒽醌类似的化合物研究印迹敏感膜的电化学响应.由于米托蒽醌是一种合成的氨基蒽醌类药物，其结构类似阿霉素，作用机理也与阿霉素相似，抗肿瘤活性与阿霉素类似或高于阿霉素，但心脏毒性却明显低于阿霉素，因此选用结构、作用机理与米托蒽醌类似的阿霉素作为验证物，按以上实验方法进行实验.结果发现，恒电位下洗掉模板分子(MTX)的印迹膜对铁氰化钾溶液中的阿霉素没有响应.可 见，由于实验中所用的阿霉素与米托蒽醌分子印迹孔穴不匹配，因而不能封闭孔穴， Fe(CN)离子扩散不受阻碍，导致电极对铁氰化钾的峰电流响应没有变化，体现了其良好的选择性. 2.6 pH影响 由于米托蒽醌和分子印迹聚合膜中孔穴的结合基于氢键作用，显然溶液的 pH会影响两者的结合.实验结果显示，在pH接近中性时峰电流最低，响应最大，说明在中性溶液中米托蒽醌分子更容易进入印迹孔穴与邻氨苯酚形成氢键，使孔穴封闭，并使 Fe(CN)扩散受阻，导致玻碳电极表面 Fe(CN)浓度减小，还原电流减小.而在强酸性溶液中，氢键易被破坏，孔穴难以封闭；在强碱性溶液中则由于Fe部分与碱发生反应而使峰电流下降造成误差.因此在实际测量中，考虑到药物分析的特点，一般应选用中性或微酸性溶液. 2.7线性范围、检出限和重现性 应用差分脉冲伏安法(电位范围-0.2~0.5V，电位增量5mV，脉冲幅度 50mV，脉冲宽度5s，脉冲间隔0.1s)研究了在4.0 ×10mol/L的K[Fe(CN)](pH=6.64)背景溶液中加入不同浓度的 米托蒽醌，同时考察了对印迹膜的响应，结果如图7所示.由图7可以看出，米托蒽醌浓度分别在 3.3X107~1.0×10mol/L(y=-0.1346x+40.287，R’=0.9981)及 1.0 ×105~5.0 ×10mol/L (y=-0.0391x+30.58，R’=0.9972)范围内与峰电流减小量呈线性关系，检测限为1.6 ×10'mol/L，说明该方法有较好的灵敏度. 将使用过的电极用0.5mol/L的 HSO溶液洗涤10min， 再用二次蒸馏水洗2min即可使电极基本恢复到响应前的状态.应用该传感器，对1.0× Fig7 Rela tion sh ip between the M TX concen tra tionand peak current 10°mol/L的米托蒽醌平行测定5次，相对标准偏差为1.28%，表明该方法具有较好的重复性和再现性(表1).此外，该传感器在连续使用7d及重复使用180次后尚能得到同样的实验结果(相对标准偏差小于5.0%).随着时间的延长及使用次数的增加(200次)，传感器响应会逐渐减小(相对标准偏差达到7.2%). Table 1 .Reproduc ib ility of in printed electrode to 1.0 X10mol/L MTX solution Number Current value withoutMTX/uA Current value after adding MTX/uA Current increment value/uA 1 37.82 26.86 10.96 2 37.95 26.97 10.98 3 37.87 26.90 10.95 4 37.94 26.96 10.98 5 38.02 27.08 10.94 * RSD=1.28%. 2.81样品分析 对人体血液中的MTX进行加标回收实验，分析步聚如下：取4份人新鲜血液各0.1mL，分别加入1mL无水乙醇，充分振荡，使血液中的蛋白质凝聚，离心沉降.取上层清液，一份为空白，其它3份分别加入1.0×10，5.0 ×10及1.0×10mol/L的MTX，用4 ×10mol/L K[Fe(CN)6](pH=6.64)的背景溶液稀释到10mL，按以上实验方法进行测定，测定结果见表2. Table 2 Recovery of the proposed m ethod Sample c(addedMTX) /(mmol·L -) c(foundMTX)/(mmol·L) Recovery(%) 1 0 0 0 2 0.001 0.00094 94.0 3 0.005 0.00476 95.2 4 0.010 0.00970 97.0 从表2中数据可见，印迹敏感膜电极对米托蒽醌有较好的回收率(94%以上)，这为该电极用于快 速检测米托蒽醌药物奠定了良好的基础. ( 参 考 文 献 ) ( [1] YOU QiDong(尤启东). Medi c ine Chem istry (药物化学)[M]， B e ijing： Chemical Industry Press， 2 0 03： 5 3 1 ) ( [2] Katharina M. R.， R eto A. . J oumal of Chromatography B： B i omedical Sciences and Applications[J ] ， 199 6 ，679(26)：185—192 ) ( [3] SaiL. L.， Tsuei F. J.. Joumal of Chiomatography A[ J ]，1994，670(3)：234—238 ) ( [4] K un T L . ， Georges E R . ， Jean M. L .. Journal of Chromatography A[J] ， 1989 ， 465 ： 75-86 ) ( 「51 L I HuiL in(李会林). Chinese Joumal of Phamaceuticals(中国医药工业杂志)[J]，1997， 28(4)： 1 17一119 ) ( [6] ZHOU ZeQing(周泽清)， WU C hao-Yuan(伍朝员)， ZHANGL i n-Kui(张林魁)，et al. Chinese Jo u mal of Phamaceutical Analysis (药物分析杂志)[J]，1997， 17(6)：403—405 ) ( [7] HE S hu-Hua(何树华)， HE De-Yong(何德勇)， ZHANG Zhu-Jun (章竹君). Joumal o f Nanjing Nomal University， Natural Science Edition(南京师范大学学报，自然科学版)[J]，2006，31(5)：108—110 ) ( [8] WANG Fen(王芬)， LU Zh o ng-Fang(刘忠芳)，LU Shao - Pu(刘绍璞)， et al. Che m . J. Ch i nese Universities(高等学校化学学报) [J]，2006， 2 7(8)：1459—1461 ) ( [9] GUO ManDong(郭满栋). Joumal of Analytical Science(分析科学学报)[J]，1995，11(2)：46—48 ) ( [10] HU JinBo(胡劲波)，LI Q iLong(李启隆). Che m . J. Ch i nese Universities(高等学校化学学报)[J]，2001，22(3)：380—384 ) ( [11]HUJinBo(胡劲波)，LIQiLong(李启隆). Joumal ofBeijing NommalUniversity， Natural Science Edition(北京师范大学学报，自然科学版)[J]，2003，39(2)：226—229 ) ( [12] QUWan-Yun(瞿万云)， YANG Chun-Hai(杨春海)， ZHANG Sheng-Hui(张升晖). Joumal of Wuhan University (武汉大学学报) [J]，2006，52(4)：439—443 ) ( [13] ZHANG AiQiang(张爱强)， CHEN Yan-Zhen(陈衍珍)， TAN ZhaoWu(田昭武). Acta P h ysico-Chem ica S i nica (物理化学学报) [J]， 1991 ， 7(2)： 1 46—151 ) Sdudy and Applica tion of M itoxan trone Sen sorBa sed on M olecular mprinting WU Wu-Ai， YN Zhi-Fen， WEIJing-Rui， GUO Man Dong (D eparm ent of Chen istry， ShanxiNomal University， L infen 041004， China) AbstracttUnder the condition of weak acidity， a sensitive fim was prepared through the electropolymeriza-tion of o-am inophenol on a glassy carbon electrode surface in the presence of m itoxantrone which was consid-ered as the template A mitoxantrone sensor based on molecular mprinting was obtainedd The sensor exhibitsa good selectivity and sensitivity to mitoxantroneTThe detemm ination lim it of the mitoxantione was 1.6 X10'mol/L， and a linear relationship between the peak current and the mitoxantrone concentration was found in therange from 3. 3 10’ to 1.0 ×10mol/L and from 1.0 X10 to 5.0 ×10°mol/L. Also， the configurationand characteristics of the fim were investigated in detail Keywords Molecular imprinting； M itoxantrone； Sensor ( (Ed ： A， G) ) C China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved http：//www.cnki.net