食品中果聚糖检测方案(离子色谱仪)

thermoscientific 仪器 离子色谱法测定食品中果聚糖 韩春霞潘广文李仁勇 关键词 离子色谱法；果聚糖；食品；婴幼儿配方奶粉目标 建立离子色谱法测定食品中果聚糖的方法。 引言 果聚糖(fructan ) 是自然界中普遍存在的一类主要以果糖基果糖为糖苷键连接而成的碳水化合物总称。果聚糖有两种来源，一种是天然来源，一种是工业来源。大约有15%被子植物含有果糖，如菊芋块茎、洋葱、大蒜中，含量大量的果聚糖。在工业上普遍应用微生物酶发酵方法， 以蔗糖为原料生产出果聚糖。果聚糖来源不同，其结构也有差异。天然的果聚糖，果糖残基以β2→1糖苷键连结而成的线形分子，即Fn型；l以蔗糖来源的果聚糖，分子末端含有1个分子葡萄糖，即GFn 型。食品中常用的果聚糖有低聚果糖、多聚果糖、菊粉等，低聚果糖的聚合度平均为4，多聚多糖的平均聚合度为23，菊粉的平均聚合度为10。 研究表明，果聚糖具有具有调节肠道菌群，增殖双歧杆菌，促进钙的吸收，调节血脂，免疫调节，抗龋齿等保健功能的新型甜味剂，已在乳制品、乳酸菌饮料、固体饮料、糖果、饼干、面包、果冻、冷饮等多种食品中应用。 由于食品中含有的低聚糖种类众多，通过直接测定低聚果糖的方法易受其他低聚糖的干扰，因此现有的标准方法多采用酶解的方法，将样品中的低聚果糖酶解后，通过果糖的含量换算出低聚果糖的含量，如 AOAC 方法 997.08。 2015年8月31日国家卫生和计划生育委员会发布了《食 品中果聚糖的测定》(GB5009.255-2016)，使用离子色谱法测定食品中的果聚糖。样品经热水浸提后，蔗糖经蔗糖酶水解成葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖经硼氢化钠还原成相应的糖醇，多余的硼氢化钠用乙酸中和。样品中的果聚糖经过果聚糖酶水解成果糖和葡萄糖，经离子色谱-脉冲安培检测器测定果糖含量，通过换算系数，折算得到果聚糖的含量。 Thermo ScientificM DionexMICS-离子色谱系统，包括： -ICS-5000 DP 色谱泵 -ICS-5000 DC 检测器 Thermo ScientificTM Dionex TM AS-AP自动进样器 Thermo ScientificTM Dionex TM ChromeleonTM 色谱工作站 耗材 Thermo ScientificTM Dionex OnGuard II RP Cartridges(2.5cc， P/N 057084) Thermo Scientific TMTarget2 TM Nylon Syring Filters(0.45 um， 30mm， P/N F2500-1) 一次性使用无菌注射器，1mL(上海治宇医疗器械有限公司) 试剂与标准品 去离子水(18.2 MQ-cm， Thermo ScientificTM genPureProTM UV-TOC， P/N 50131948)； 马来酸(国药，分析纯)； 蔗糖酶：来源于酵母，酶活力≥300U (Megazyme，Fructan Assay Kit)； 硼氢化钠(国药，分析纯)； 冰乙酸(国药，分析纯)； 三水乙酸钠(国药，分析纯)； 果聚糖酶：来源于黑曲霉，酶活力≥10000 U (Megazyme，Fructan Assay Kit)； 50%氢氧化钠溶液(NaOH)：色谱纯 (Fisher， SS254-1)； 无水乙酸钠(CH，COONa)：纯屯≥99.0%( Sigma， 71183) ； 果糖标准物质：纯度≥99.0%； 氮气(N)：纯度≥99.9%； 试剂配制 氢氧化钠溶液(1mol/L)：量取 5.2 mL 50%氢氧化钠溶液，加水稀释至100 mL， 室温下可放置2个月。 马来酸钠缓冲溶液(100 mmol/L， pH6.5)：称取1.16g马来酸(精确至0.01 g)于150mL烧杯中，加入约70 mL水溶解，用1 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 6.5，用水稀释至100mL。4℃保存，可放置3个月。 蔗糖酶溶液(4.5U/mL)：将蔗糖酶(活力为300U)溶解于66 mL 马来酸钠缓冲溶液，分装到2mL的离心管 中，-20℃保存，可放置6个月。使用前需测定酶活力。氢氧化钠溶液(50mmol/L)：称取 2.6 mL 50%氢氧化钠溶液，加水稀释至1000mL， 室温下可放置2个月。 ( 硼氢化钠溶液(10 mg/mL)：准确称取适量硼氢化钠(精 确至 0.001g)于聚丙烯离心管中，用50 mmol/L 氢氧化 钠溶液溶解，最终质量浓度为10 mg/mL， 用时现配。 ) ( 乙酸溶液(200 mmol/L)：吸取0.6mL冰乙酸，用水稀 释至50mL，4℃保存， 司 可放置2个月。 ) ( 乙酸钠溶液(200mmol/L)：尔取1.36g三水乙酸钠(精确至0.01g ) ， 溶于水并稀释至50mL，4℃保存，可放 置2个月。 ) 乙酸钠缓冲溶液(pH4.5)：吸取 14mL乙酸溶液和11mL乙酸钠溶液混合，并用水稀释至50mL，用时现配。 ( 果聚糖酶溶液(455U/mL)：将果聚糖酶(活力为10000U) 溶解于22 mL 乙酸钠缓冲溶液，分装到2mL的离心管 中，-20℃保存， 可 放置6个月。使用前需测定酶活力。 ) ( 氢氧化钠溶液(200 mmol/L)：取 10.4 mL 50%氢氧化钠溶液，用水稀释至1000mL，通入氮气保护，缓慢摇匀，室温下可放置7 d。 ) 氢氧化钠(150 mmol/L) 乙酸钠(500 mmol/L)混合溶液：称取41g无水乙酸钠(精确至0.01 g)， 用约500 mL水溶解， 0.22 um 滤膜过滤，脱气10 min， 加入7.8 mL 50%氢氧化钠溶液，并用水稀释至1000 mL， 通入氮气保护，缓慢摇匀，室温下可放置7 d。 标准溶液的制备 果糖贮备溶液(2000 mg/L)：准确称取 0.05g(精确至0.1mg) 80℃烘干至恒重的果糖标准物质于50mL烧杯中，加入约10mL热水，待果糖溶解后，冷却至室温，用水稀释至25mL容量瓶中，摇匀，4℃保存，可放置1个月。 果糖中间溶液(80.0 mg/L)：吸取果糖贮备溶液1mL，用水稀释至25mL容量瓶中，用时现配。 果糖标准曲线工作溶液：取适量果糖中间溶液，用水配制成质量浓度为 0.800 mg/L、1.60 mg/L、4.00 mg/L、8.00mg/L、16.0 mg/L的标准曲线工作溶液。 样品前处理 准确称取奶粉2.5g(含有果聚糖约12mg)试样于150mL锥形瓶中，加入80℃热水约50 mL， 置于80℃恒温水浴 摇床中， 150 r/min 振摇 15 min 后，取出，冷却至室温，转移至100mL容量瓶中，用水分三次冲洗锥形瓶，定容，摇匀，溶液5000转/min 离心 5 min，上清液备用。 取上述溶液200 pL于10 mL 具塞玻璃试管中，加入400uL蔗糖酶溶液，旋涡振荡混匀，置于40℃恒温水浴摇床中，150 r/min 振摇 60 min 后， 加入 300 uL 硼氢化钠溶液，旋涡振荡混匀，置于40℃恒温水浴摇床中，150 r/min 振摇30 min 后，取出，冷却至室温。加入750 uL乙酸溶液， 静置10 min。加入 100 uL 果聚糖酶溶液，旋涡振荡混匀，置于40℃±1℃恒温水浴摇床中，150 r/min 振摇 30 min 后，取出，冷却至室温。转移至10mL 容量瓶中，用水分三次冲洗玻璃试管，定容，摇匀。 活化 OnGuard II RP柱，试样溶液依次通过 0.22 um水相滤膜和RP柱，弃去前面3倍柱体积洗脱液，收集后面洗脱液待测。同时做试剂空白试验。 色谱条件 分析柱： Thermo Scientific Dionex CarboPac PA1，4x250 mm( P/N 035291)； 保护柱： Thermo Scientific Dionex CarboPac PA 1，4x50 mm (P/N 043096)； 淋洗液：A：水；B：氢氧氢钠溶液(200mmol/L)；C：氢氧化钠(150 mmol/L)乙酸钠(500 mmol/L)； 混合溶液。梯度洗脱条件见表1。 表1.梯度先脱条件 时间 流速 淋洗液(%) 曲线 min mL/min A B C 0-20 1.0 80 20 0 5 20.1-30 1.0 0 0 100 5 30.1-40 1.0 0 100 0 5 40.1-50 1.0 80 20 0 5 进样体积：10uL 柱温：30℃ 检测器：安培检测器，金电极， Ag-AgCl参比电极，糖四电位波形 检测池温度：：35℃ 结果与讨论 色谱柱的选择 赛默飞公司开发了专门用于糖类化合物分离的 CarboPac系列色谱柱，其中 CarboPac PA10、PA20 常用于单糖、 二糖、低聚糖的分离， CarboPac PA100、PA200 常用于低聚糖和多糖的分离， CarboPac MA1 用于糖醇的分离，CarboPac PA1 为通用色谱柱。由于本实验中，总糖含量较高，选用了柱容量较高 CarboPac PA1， 以保证果糖与其他单糖有较好的分离，且果糖峰在对照图谱和样品图谱中保留时间一致。 图1.对照溶液图谱 图2.样品溶液图谱 标准曲线 0.800 mg/L、1.60 mg/L、4.00 mg/L、8.00 mg/L、16.0 mg/L的标准曲线工作溶液分别进样，以离子浓度(mg/L)为横坐标，以峰面积的平均值为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表2。线性范围宽，线性相关系数良好，满足定量分析需要。 表2.果糖的线性范围、标准工作曲线、方法定量限和精密度 名称 线性范围 线性方程(mgL-1) LOQ RSD(%) (mgL-1) (mgL-1) (n=5) 胱氨酸 0.8~16.0 Y=0.1344X+0.6789 99.99 0.02 1.8 结果的计算 试样中果聚糖含量按式(1)、式(2)、式(3)计算： -1 ( X——— -试样中果聚糖的含量，单位为克每千克(g/kg)； ) ( k1—— 一 — 对果聚糖水解过程中增加的水分子进行校正； ) ( k2 ———对于 Fn 型聚聚糖末端果糖基被还原和 GFn 型果聚糖末端葡萄糖不被检测进行校正； ) ( C——— 一试样测定液中果糖的质量浓度，单位为毫克每升(mg/L) ； ) ( cO· )———i -试剂空白测定液中果糖的质量浓度，单位为毫克每升(mg/L)； ) ( V— — — -试样定容体积，单位为毫升(mL)； ) ( 10—— -试样酶解液定容体积，单位为毫升(mL)； ) ( m—— -试样质量，单位为克(g)； ) ( 0.2—— -用于酶解的样品溶液体积，单位为毫升(mL)； ) ( 1000———单位转换系数； ) n———平均聚合度，对于低聚果糖，按照n=4计算；对于多聚果糖，按照n=23计算；对于菊粉，按照n=10计算； ( 计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数字。 ) 测定结果和回收率 表3.样品测定结果及加标回收率实验 加标量(mg/L) 测得量 加标后含量(mg/L) 回收率% (mg/L) 96% 结论 本方法使用蔗糖酶、硼氢化钠、果聚糖酶对样品进行了前处理，消除了基体中的高塘对多聚糖测定的干扰。采用离子色谱电化学法检测食品中的果聚糖，方法简单，灵敏度高。 ( 参考文献 ) ( [1]仝瑛， ，倪士峰， 罗 启超等.果聚糖的药学研究进展[J]. 西北药学杂志，2009，24(6)：525 ) thermoscientific S CIENTIFIC 支持手机用户)A Thermo Fisher Scientific Brand