酵母中RNA检测方案(研磨机)

酵母菌高效破壁方法的革新——终极研磨手段：冷冻研磨法 酵母菌是基因表达研究和重组蛋白生产的通用宿主。然而，传统酶解法进行酵母 mRNA 和内容蛋白提取通常非常困难。我们以细胞总 RNA 提取为例，对各种酵母破壁方法进行比较。我们用不同的方法对酵母菌破壁，然后用 Trizol 试剂进行 RNA 的提取，最后进行电泳检测，发现不同破壁方法效果如下： 破壁方法 破壁操作 结果 评价 蜗牛酶酶解法 取1ml对数生长期菌液，5000rpm 离心去上清，留下约100pl培养基，混匀。加入蜗牛酶至浓度为 20mg/ml，在37°C水浴中酶解 90min 1 2 泳道1为提取 RNA泳道2为 Marker 没有明显条带，说明此法不适用于酵母中RNA提取 加玻璃珠涡旋振荡法 取1ml对数生长期菌液，5000rpm 离心去上清，留下约200ul培养基，加入体积约为100pl的玻璃珠，涡旋振荡10-25min 后， 5000rpm离心 5min 1234 5- 泳道1-4分别用玻璃珠处理10、15、20、25min， 5为Marker 只出现亮度极低的弥散条带，这说明此法不适用于酵母总RNA提取 超声波法 取1ml对数生长期菌液，5000rpm 离心去上清，留下约300ul培养基，混匀。然后再冰浴中超声波处理，超声功率200W， 工作时间1s，间隔1s 1 2 3 泳道1样品超声20次，泳道2样品超声10次，泳道3Marker 能提出完整的总RNA，但泳道前方有明显的弥散条带，说明超声波会打断RNA 链形成小分子RNA。 反复冻融法 取1ml对数生长期菌液，5000rpm 离心去上清，留下约100ul培养基，混匀。快速放入液氮浸泡3s，，然在37°C水浴中浸泡至冰冻菌液完全融解，如此反复3次。 2 泳道1为总 RNA泳道 2Marker 能较好的破碎酵母菌细胞壁，且保证了RNA 完整性。 液氮研磨法 取1ml对数生长期菌液，5000rpm 离心去上清，将菌体移至研钵，加入一定量液氮，迅速研磨，液氮挥发完后，再次加入液氮进行研磨，反复3次。将研磨后的菌粉移至1.5mlEP 管 2 泳道1是总RNA泳道2为 Marker 可以看到两条明显的条带(28SRNA 和18SRNA)，无明显的小分子弥散条带，这说明此法能很好破碎酵母菌细胞壁，且能保证RNA完整性。 从上述结果可以看出反复冻融法和液氮研磨法是酵母破壁提取总、R RNA 最合适的方法。但是对于酵母来说，科研工作者往往对其内容蛋白也十分感兴趣。众所周知，反复冻融法对蛋白活性造成不可逆的破坏，甚至可能导致蛋白变性。那么对于酵母研究的专业实验室来 说，液氮研磨法即是不二之选。 然而，上表中传统的液氮研钵研磨的方法毕竟是手工的方法，对于不同种类的酵母，!以及不同种类的目标蛋白，研磨时间会有不同。由于人为手工的实验无法达到平行的实验效果，所以实验摸索困难。当然，在研磨过程中也可能产生粉尘污染样品。 所以酵母研究工作者亟需一个合适的工具来协助科研。 SPEX公司 Freezer/Mill 冷冻研磨仪将上述液氮研磨法进一步改良，使酵母破壁这样的实验更加简单，无人值守即可完成。将样品装入密闭的研磨容器，浸入液氮，采用电磁振荡技术，电磁往复驱动钢制撞子，振荡装机样品，动能惯性更大，实现高动能撞子大面积撞击，快速粉碎研磨。过程中，样品始终处于液氮温度(-196°C)。 实验方法： 第一步：将样品研磨罐预冷冻。 第二步：将酵母菌液加入液氮中，控制速度，使菌液进入液氮中后形 成小颗粒。将菌体液氮颗粒转入研磨罐中。放入冷冻研磨仪的样品仓。 第三步：设置研磨程序，预冷10-15min，，研磨 2min， 15个循环，，两次研磨之间间歇 1min。 实验结果： 经检验，用此法能使得90%以上的酵母细胞破壁。酵母的 RNA和细胞内蛋白保持高活性。